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        腦缺血再灌注大鼠血漿脂聯(lián)素及其組織表達的研究

        2012-02-26 01:53:38周喜燕呂以靜逄世敏
        關(guān)鍵詞:血漿

        周喜燕,呂以靜,李 寧,逄世敏

        腦血管病中腦梗死占80%以上,生存者中的病殘率達70%~80%,嚴重危害人類的生命與健康,給社會和家庭帶來沉重的負擔(dān)[1]。本課題研究大鼠腦缺血再灌注前后血漿脂聯(lián)素(APN)水平與其在頸動脈內(nèi)膜表達的變化,來探討脂聯(lián)素與腦梗死發(fā)生的關(guān)系,為腦血管病的預(yù)防與診療提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料 脂聯(lián)素ELISA試劑盒(美國Invitrogen公司 貨號KRP0041),脂聯(lián)素免疫組化試劑盒(英國abcam公司 貨號ab62551),二步法IHC檢測試劑(北京中杉金橋公司貨號:PV-6000-G),SABC免疫組化試劑盒/DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司),內(nèi)皮素-1(ET-1,Merck公司 貨號05-23-3800-0.1 MG)。

        1.2 動物與分組 封閉群純種SPF級Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠30只,體重180 g±20 g,自然光線,自由飲水,自由攝食條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。分別稱重標(biāo)記,采用隨機法分為A組(正常對照組)、B組(缺血再灌注組),每組15只。

        1.3 動物模型制備 參考顧國軍等[2]方法,B組復(fù)制缺血再灌注大鼠模型。俯臥位固定于腦立體定向儀上,以保溫床墊維持肛溫在(37.5±0.5)℃,在顱頂沿正中線做一長約1.5 cm的切口,暴露顱骨,以前囟為標(biāo)志,向前0.9 mm,向左旁開5.2 mm,向下8.7 mm 植入 ET-1導(dǎo)管。將 ET-1(60 pmol/μL)以0.6 μL/min的速率注射到 MCA附近,留針5 min,緩慢拔針,退針后縫合頭皮。術(shù)口局部施以消毒酒精抗感染。1.4 標(biāo)本處理及觀察指標(biāo)

        1.4.1 血漿脂聯(lián)素檢測 每組大鼠于復(fù)制模型前后隨機抽取10只,依次用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(300 mg/kg,必要時補充注射)后,經(jīng)眼眶采血,接取5 m L至分離膠管中,4℃,3000 r/min離心10 min,取上層血清,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA法)進行檢測,操作過程中嚴格按照試劑盒說明進行。1.4.2 頸動脈脂聯(lián)素檢測 每組大鼠于復(fù)制模型前后隨機抽取3只,分別經(jīng)水合氯醛麻醉,迅速剝離頸總動脈,用止血鉗把周圍肌肉組織和神經(jīng)組織剝離后穿雙線,遠心端結(jié)扎,近心端用動脈夾阻斷血流,剪下頸總動脈,縱向切開后,于生理鹽水中沖洗,放入4%多聚甲醛中,固定6 h~8 h,石蠟包埋。做3μm厚連續(xù)切片,進行免疫組織化學(xué)染色。

        脂聯(lián)素免疫組織化學(xué)檢測:常規(guī)脫蠟至水,抗原修復(fù),封閉內(nèi)源性過氧化物酶。蘇木素復(fù)染后,自來水返藍。脫水,透明,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察。設(shè)置陰性對照,采用PBS代替一抗、二抗及SABC,結(jié)果為陰性。

        1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用t檢驗/方差分析;方差不齊時采用秩和檢驗(Keuskal-Wallis法等)。計數(shù)資料組間比較采用卡方檢驗。

        2 結(jié) 果

        2.1 兩組大鼠血漿脂聯(lián)素水平變化 缺血再灌注造模后,血漿脂聯(lián)素水平較造模前降低,有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

        表1 腦缺血再灌注造模前后APN水平( ±s) ng/m L

        表1 腦缺血再灌注造模前后APN水平( ±s) ng/m L

        組別 n 造模前 造模后A組8 12.09±2.54 12.11±3.00 B組 8 12.25±4.14 7.43±3.321)2)

        2.2 兩組大鼠頸動脈脂聯(lián)素的表達 免疫組化圖片背景為紫藍色,脂聯(lián)素陽性表達在血管壁,呈棕褐色。血管壁纖維和內(nèi)皮細胞著色。免疫組化結(jié)果顯示:造模后血管壁脂聯(lián)素的陽性表達強度(2+)弱于造模前(3+)。

        3 討 論

        脂聯(lián)素是脂肪細胞分泌的一種脂肪細胞因子,由Scherer等[3]于1995年首先從鼠的脂肪細胞分離出來,1999年Arita等[4]將其命名為脂聯(lián)素。近年來研究發(fā)現(xiàn),脂聯(lián)素不僅與肥胖、胰島素抵抗、糖尿病密切相關(guān),還在動脈粥樣硬化過程中起著重要的調(diào)控作用。與心腦血管病等多種疾病密切相關(guān)。

        低脂聯(lián)素水平參與腦梗死的發(fā)病過程,與頸動脈粥樣硬化有一定關(guān)系,尤其與不穩(wěn)定斑塊形成密切相關(guān)。本實驗結(jié)果表明,急性缺血再灌注大鼠造模后血漿脂聯(lián)素水平和頸動脈內(nèi)膜脂聯(lián)素表達均低于造模前(P<0.05)。脂聯(lián)素可能通過以下幾個方面預(yù)防缺血性腦卒中的發(fā)生:抑制單核細胞黏附血管內(nèi)皮細胞;抑制血管平滑肌增殖遷移[5];抑制巨噬細胞向泡沫細胞的轉(zhuǎn)化[6];增加脂肪酸氧化,降低三酰甘油、游離脂肪酸含量[7],改善脂肪代謝,發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用。因此,脂聯(lián)素有可能成為腦梗死的風(fēng)險預(yù)測因子,為防治缺血性腦卒中提供理論依據(jù),針對血漿脂聯(lián)素水平降低的治療可能有助于降低腦梗死的預(yù)防和治療。

        [1]李志.針刺對急性腦梗死合并血脂異?;颊哐降挠绊懀跩].中醫(yī)藥學(xué)刊,2006,24(4):744.

        [2]顧國軍,黃振興,陶凱忠,等.HBO-1對內(nèi)皮素-1誘導(dǎo)的大鼠局灶性腦缺血模型的療效觀察[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2006,27(10):1134-1137.

        [3]Scherer PE,Williams S,F(xiàn)ogliano M,etal.A novel serum protein similar to Clq,produce dexclusively in adipocytes[J].J Biol Chem,l995,270(45):26746-26749.

        [4]Arita Y,Kihara S,Ouchi N,etal.Paradoxical decrease of an adipose specific protein radiponectin,in obesity[J].Biochem Biophys Res Commun,1999,257(1):79-83.

        [5]Arita Y,Kiahara S,Ouchi N,etal.Adipocyte-derived plasma protein adponectin acts as a platelet-derived growth factor-BB binding protein and regulates growth factor-induced common postreceptor signal in vascular smooth muscle cell[J].Circulation,2008,105(24):2893-2898.

        [6]Yokota T,Oritani K,Tckahashi I,etal.A diponeetin,a new member of the family of soluble defense collagens,negatively regulates the growth of myelomonocytic progenitors and the functions of macrophages[J].Blood,2007,96(5):1723-1732.

        [7]Betowski J.A diponection and resistin-new hormones of white adipose tissue[J].Med Sci Monit,2005,9:RA55-RA61.

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