劉婷婷，馬麗娜，李鳳云，劉 勇

傷寒沙門(mén)菌（Salmonella typhi）是重要的腸道致病菌，屬胞內(nèi)寄生菌，可引起傷寒等嚴(yán)重疾病。巨噬細(xì)胞是人體主要的吞噬細(xì)胞，在許多病原體的清除和破壞中起重要作用。傷寒沙門(mén)菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)生存、增殖的能力與其致病密切相關(guān)。傷寒沙門(mén)菌侵襲性蛋白Sip－B可以誘導(dǎo)caspase1介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡［1］，但這些細(xì)菌毒力因子的表達(dá)在宿主體內(nèi)、外是不同的［2］，人體內(nèi)環(huán)境因素對(duì)傷寒沙門(mén)菌誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響還有待于進(jìn)一步研究，其中就包括傷寒沙門(mén)菌被巨噬細(xì)胞吞噬后所遭遇的細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)擬用H2O2刺激傷寒沙門(mén)菌以模擬體內(nèi)氧化條件，采用人單核細(xì)胞株經(jīng)PMA分化的巨噬細(xì)胞為模型，探討傷寒沙門(mén)菌在氧化應(yīng)激狀態(tài)下誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡，以深入了解傷寒沙門(mén)菌的致病機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 菌種 傷寒沙門(mén)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 19430，購(gòu)自北京中國(guó)藥品生物制品鑒定所；氧化應(yīng)激傷寒沙門(mén)菌，參照文獻(xiàn)［3］方法制備。

1．1．2 主要試劑 Annexin VFITC凋亡檢測(cè)試劑盒（深圳晶美生物工程公司），人TNFα定量酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒（上海森雄生物技術(shù)有限公司），SOD檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1．1．3 主要儀器 流式細(xì)胞儀FACS Calibur（美國(guó)BD公司）。

1．2 方法

1．2．1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含小牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液培養(yǎng)人單核細(xì)胞株，加入20ng／mL使其分化，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)48h，鏡下觀(guān)察90%以上細(xì)胞出現(xiàn)棘狀突起時(shí)判定細(xì)胞已分化成巨噬細(xì)胞。收獲指數(shù)生長(zhǎng)期巨噬細(xì)胞，以5×105接種于無(wú)菌6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)5h后更換不含小牛血清的營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行試驗(yàn)。

1．2．2 細(xì)菌培養(yǎng) 細(xì)菌分別在LB液體培養(yǎng)基和加有15mmol／L H2O2的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，16h后使用酶標(biāo)儀測(cè)A600值；計(jì)算菌液濃度，用不含小牛血清的RPMI－1640調(diào)整菌液濃度。

1．2．3 細(xì)胞感染 棄去細(xì)胞培養(yǎng)孔中陳舊培養(yǎng)液，加入1．0mL不含小牛血清營(yíng)養(yǎng)液，按細(xì)菌與細(xì)胞數(shù)之比為20∶1加入細(xì)菌。實(shí)驗(yàn)分為A組（傷寒沙門(mén)菌誘導(dǎo)組）、B組（氧化應(yīng)激組）和C組（空白對(duì)照組）。

1．2．4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 分別于感染細(xì)菌后2、4、8、12h收集細(xì)胞，Annexin V－FITC染色，1h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Cellquest軟件獲取數(shù)據(jù)。

1．2．5 TNF－α、SOD檢測(cè) 細(xì)菌感染8h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，采用定量酶聯(lián)法檢測(cè)TNF－α，按照說(shuō)明書(shū)操作，用酶標(biāo)儀測(cè)A492值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到TNF－α含量。SOD的檢測(cè)采用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)細(xì)菌感染8h細(xì)胞培養(yǎng)液上清，用可見(jiàn)光分光光度計(jì)在550nm處檢測(cè)，通過(guò)公式可求出樣本SOD活力。1．2．6 數(shù)據(jù)處理 所得數(shù)據(jù)用Excel和SPSS10．0進(jìn)行計(jì)算和分析。采用one－way ANOVA后t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2．1 氧化應(yīng)激狀態(tài)下傷寒沙門(mén)菌及自然狀態(tài)傷寒沙門(mén)菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡的流式分析 各時(shí)間段氧化應(yīng)激狀態(tài)下傷寒沙門(mén)菌及自然狀態(tài)傷寒沙門(mén)菌均可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡，與對(duì)照組相比細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01），隨時(shí)間延長(zhǎng)，各組細(xì)胞凋亡率亦相應(yīng)增加（P＜0．01）；各時(shí)間段氧化應(yīng)激狀態(tài)下傷寒沙門(mén)菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡率與自然狀態(tài)傷寒沙門(mén)菌組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）。

圖1 巨噬細(xì)胞凋亡的流式圖A：對(duì)照組；B：自然狀態(tài)傷寒沙門(mén)菌組；C：氧化應(yīng)激狀態(tài)傷寒沙門(mén)菌組）Fig．1 Time－dependent effect of macrophage apoptosis inducedA：control；B：s．typhi；C：H2O2stressed s．typhi with flow cytometry

圖2 氧化應(yīng)激狀態(tài)下傷寒沙門(mén)菌及自然狀態(tài)下傷寒沙門(mén)菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞不同時(shí)間的細(xì)胞凋亡率 （ni＝6，±s）＊：與自然狀態(tài)傷寒沙門(mén)菌組及對(duì)照組比較Fig．2 Apoptosis rates of macrophage induced by S．typhi grown under normal and H2O2stressed conditionCompared to control and normal S．typhi infected macrophages，P＜0．01

2．2 細(xì)菌誘導(dǎo)8h后TNF－α及SOD的產(chǎn)生量氧化應(yīng)激狀態(tài)傷寒沙門(mén)菌及自然狀態(tài)傷寒沙門(mén)菌組誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞8h后，TNF－α的產(chǎn)生量均比加入誘導(dǎo)因素前明顯增高，且氧化應(yīng)激菌TNF－α高于自然狀態(tài)傷寒沙門(mén)菌組；SOD的產(chǎn)生量均比加入誘導(dǎo)因素前明顯減少，且氧化應(yīng)激菌SOD的產(chǎn)生量均低于自然狀態(tài)傷寒沙門(mén)菌組，見(jiàn)圖4－6。

圖3 自然狀態(tài)傷寒沙門(mén)菌及氧化應(yīng)激狀態(tài)傷寒沙門(mén)菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞TNF－α產(chǎn)生量 （ni＝6，±s）＊：與對(duì)照組及自然狀態(tài)傷寒沙門(mén)菌作用巨噬細(xì)胞組比較Fig．3 Production of TNF－αafter 8hin the culture supernantants of macrophages interacted with S．typhi under normal and H2O2stressed conditionsCompared to control and normal S．typhi infected macrophages，P＜0．01

3 討 論

圖4 自然狀態(tài)傷寒沙門(mén)菌及氧化應(yīng)激狀態(tài)傷寒沙門(mén)菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞SOD產(chǎn)生量 （ni＝6，±s）＊：與對(duì)照組及自然狀態(tài)傷寒沙門(mén)菌作用巨噬細(xì)胞組比較Fig．4 Production of TNF－αafter 8hin the culture supernantants of macrophages interacted with S．typhi under normal and H2O2stressed conditionsCompared to control and normal S．typhi infected macrophages），P＜0．01

氧化應(yīng)激即機(jī)體活性氧（reactive oxygen specises，ROS）產(chǎn)生過(guò)多或／和抗氧化能力下降，ROS清除不足，導(dǎo)致ROS在體內(nèi)過(guò)多堆積而造成細(xì)胞損傷。感染過(guò)程中，在細(xì)胞因子的影響下，傷寒沙門(mén)菌遭遇了巨噬細(xì)胞內(nèi)的氧化環(huán)境，巨噬細(xì)胞利用其產(chǎn)生的氧衍生物分子以抑制或殺死傷寒沙門(mén)菌，但仍有部分傷寒沙門(mén)菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)生存并導(dǎo)致感染。為了應(yīng)對(duì)環(huán)境的應(yīng)激，傷寒沙門(mén)菌經(jīng)歷了遺傳以及物理性狀的改變。這些應(yīng)激反應(yīng)可能會(huì)顯著的增強(qiáng)傷寒沙門(mén)菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存能力及毒性［4］。本實(shí)驗(yàn)著重探討了傷寒沙門(mén)菌如何應(yīng)對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)的氧化環(huán)境以及巨噬細(xì)胞凋亡與ROS之間的關(guān)系。

氧化應(yīng)激狀態(tài)下自然狀態(tài)傷寒沙門(mén)菌，采用Annexin V－FITC染色、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果兩組細(xì)菌均可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡，且細(xì)胞凋亡率隨時(shí)間延長(zhǎng)而增高（P＜0．01），各組氧化應(yīng)激狀態(tài)傷寒沙門(mén)菌引發(fā)巨噬細(xì)胞凋亡能力均高于自然狀態(tài)傷寒沙門(mén)菌組，說(shuō)明模擬巨噬細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激條件傷寒沙門(mén)菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡能力增強(qiáng)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，氧化應(yīng)激狀態(tài)傷寒沙門(mén)菌組較自然狀態(tài)傷寒沙門(mén)菌感染組誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的SOD明顯降低。SOD是一種重要的抗氧化酶，具有清除自由基，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的作用。SOD水平的下降可能引起過(guò)氧化自由基的產(chǎn)生從而引起巨噬細(xì)胞的凋亡，已經(jīng)有報(bào)道這種過(guò)氧化物可引起神經(jīng)細(xì)胞的凋亡［5］。早期的研究中有人發(fā)現(xiàn)，缺乏SOD的大腸桿菌在需氧生長(zhǎng)中突變率增強(qiáng)，這表明缺乏SOD可導(dǎo)致DNA的損害。另外，SOD的顯著減少有可能阻礙了超氧陰離子防止突變以及H2O2的解毒作用，因而可能造成凋亡的羥基離子和其他活性氧成分的形成［6］。

許多研究已證實(shí)氧化應(yīng)激可引起細(xì)胞凋亡，這其中凋亡可由活性氧中間物產(chǎn)生，也可由抗氧化劑的使用而被阻止。TNF－α就是這樣一種調(diào)劑因子。Larrick和Wright曾報(bào)導(dǎo)給予TNF受體刺激后可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧中間物水平的迅速上升［7］。而且在不同的細(xì)胞，TNF－α介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可由硫氧化還原劑，或 N－已酰半胱氨酸，和GSH 前體所抑制［8］。TNF－α，INF－α和IL－1也曾經(jīng)被報(bào)道可引起不同類(lèi)型細(xì)胞凋亡［9］。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激下傷寒沙門(mén)菌組較原菌感染組誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放的TNF－α明顯增多，這個(gè)結(jié)果跟Hirose早期研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞對(duì)TNF－α敏感度和抵抗力是和SOD水平的降低或升高密切相關(guān)是一致的，SOD缺陷的T細(xì)胞已被證實(shí)更易被 TNF－α殺傷［10］。

氧化應(yīng)激狀態(tài)下傷寒沙門(mén)菌可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡，TNF－α在傷寒沙門(mén)菌氧化應(yīng)激時(shí)通過(guò)增加ROS和減少抗氧化物SOD的產(chǎn)生來(lái)介導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡，本研究結(jié)果有助于我們更好的理解傷寒沙門(mén)菌的致病機(jī)理，為我們進(jìn)一步的診斷與治療提供了新的思路。

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