宋增梅，黃慧聰，潘長旺

蛋白質(zhì)組學是一門迅速發(fā)展的學科，在疾病或組織的蛋白表達和功能研究中，雙向凝膠電泳（2－DE）是強有力的研究工具［1］。雙向凝膠電泳由于其在展示全部蛋白質(zhì)表達改變并鑒定特異性蛋白方面的優(yōu)勢，已成為目前蛋白質(zhì)組學研究首選的分離技術(shù)［2］。

廣州管圓線蟲病，又稱嗜酸粒細胞增多性腦膜炎或嗜酸粒細胞增多性腦膜腦炎，是由廣州管圓線蟲（Angiostrongyluscantonensis）寄生于人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)所致，是一種人獸共患病。但是，目前國內(nèi)外關(guān)于廣州管圓線蟲蛋白組學的報導不多，亦無關(guān)于此線蟲系統(tǒng)的雙向電泳的報道。為了建立具有高分辨率可重復的廣州管圓線蟲雙向凝膠電泳技術(shù)，我們針對雙向電泳技術(shù)中的各種參數(shù)進行初步探索和優(yōu)化，為廣州管圓線蟲蛋白質(zhì)組學的進一步研究和新功能蛋白的發(fā)現(xiàn)提供基礎(chǔ)的科學材料和參考方法。

1 材料與方法

1.1 標本來源 廣州管圓線蟲Ⅴ期幼蟲由本實驗室分離、－80℃保存。

1.2 主要試劑及儀器 尿素（urea）、硫脲（thiourea）、3－［3－（膽酰胺基丙基）二甲氨基］丙磺酸鹽（CHAPS）、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、四甲基乙二胺（TEMED）、二硫蘇糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAA）、固相膠條（IPG strip pH 3～10/pH 4～7，17cm），Bio－lyte pH 3～10，2－D clean up試劑盒等均購于Bio－Rad公司；蛋白酶抑制劑混合液（Sigma），其它化學試劑均為分析純。

PROTEAN IEF CELL聚焦儀，PROTEAN II XL垂直板電泳儀，GS－800掃描成像系統(tǒng)，PDQuest凝膠圖像分析軟件（Bio－Rad公司），722s紫外可見分光光度計。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備 50條廣州管圓線蟲Ⅴ期幼蟲用0.01 mol/L PBS洗滌3次，收集于1.5mL Ep管內(nèi)；加入200μL裂解 液（7mol/L 尿 素、2mol/L 硫 脲、4%CHAPS、40 mmol/L Tris－Base、40mmol/L DTT、0.2%Bio－Lyte）和 1 μL蛋白酶抑制劑混合液；用研磨棒在冰上研磨使其充分溶解，于凍存管中室溫靜置1h；液氮中凍融3次；4℃，12 000 r/min離心30min，收集上清；2－D clean up試劑盒處理所得上清；100μL裂解液重懸沉淀，Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度，－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 等電聚焦電泳（Isoelectronic Focusing） 參考文獻［3］方法，根據(jù)樣品情況適當改進。分別將200μg蛋白樣品與與水化上樣緩沖液（8mol/L 尿素、2%CHAPS、15mmol/L DTT、0.2%Bio－Lyte、0.001%溴酚藍）共300μL混合后均勻加入聚焦槽內(nèi)；選用pH 3～10和pH 4～7（17cm，線性）的IPG膠條，膠條膠面朝下，水化液浸濕整個膠條，上面覆蓋3mL礦物油，進行第一向等電聚焦電泳，調(diào)整運行參數(shù)如表1所示。

表1 等電聚焦參數(shù)Tab.1 The parameters of isoelectric focusing

1.3.3 第二向SDS電泳（SDS－PAGE） 聚焦后的IPG 膠條依次在平衡緩沖液 Ⅰ（6mol/L尿素、2%SDS、20% 甘油、50mmol/L Tris－HCl pH 8.8、1%DTT）和平衡緩沖液Ⅱ（前4種同上，2.5%IAA）中各平衡15min；平衡后移至12%SDS－PAGE凝膠上端，2mL熱的瓊脂糖溶液封頂。電泳參數(shù)設(shè)置為10mA/gel電泳15min后改為30mA/gel，進行電泳。

1.3.4 銀染 電泳結(jié)束后2塊凝膠按照表2的程序進行硝酸銀染色。

表2 凝膠銀染程序Tab.2 The procedures of silver staining

1.3.5 圖像的采集與處理 銀染的凝膠用GS－800Calibrated Densitometer圖像掃描儀透射掃描，PDQuest7.4.0軟件對2－DE凝膠采集圖像進行詳細處理、分析。

2 結(jié) 果

2.1 樣品的蛋白質(zhì)含量 按照Bradford法，配制不同濃度BSA作標準曲線，加入考馬斯亮藍G250工作液，波長595nm測得標準曲線相關(guān)系數(shù)為0.974 7，見圖1所示。經(jīng)計算廣州管圓線蟲Ⅴ期幼蟲蛋白含量約為10.4mg/mL。

圖1 蛋白質(zhì)濃度標準曲線Fig.1 The standard curve of protein concentration

2.2 兩種膠條進行2－DE的圖像比較 以pH3～10膠條進行的2－DE，蛋白質(zhì)點分布較集中，各蛋白點間間距較小，分辨率較低（圖2A）；以pH4～7膠條進行的2－DE，膠雖然分離蛋白范圍相對較小，但分辨率較高，蛋白點為719個，各蛋白點間距相對較大，且蛋白分布均勻，分子量大多分布在24.3～97.2kDa之間（圖2B）。

因此，在進一步進行廣州管圓線蟲蛋白質(zhì)組學研究過程中，選用固相膠條（IPG，pH4～7，17cm）進行電泳。在相隔60d后運用廣州管圓線蟲Ⅴ期雄蟲的蛋白質(zhì)進行雙向電泳后，得到如圖3所示的電泳圖譜。如圖所示，蛋白點較多且清楚，沒有明顯條紋，背景干凈清晰，蛋白分布均勻，效果比較好。

圖2 A：固相膠條pH3～10；B：固相膠條pH4～7Fig.2 A：IPG strip of pH3～10；B：IPG strip of pH4～7

圖3 廣州管圓線蟲Ⅴ期雄蟲雙向電泳銀染圖Fig.3 The silver stained map of two－dimensional electrophoresis on larvaeⅤof nake A.cantonensis

3 討 論

近年來，蛋白組學廣泛應用在血液［4］、尿液［5］、唾液［6］等組織或疾病的診斷與預后，受到人們的關(guān)注。蛋白質(zhì)組具有的高通量、大規(guī)模、整體性蛋白質(zhì)水平的研究特點成為了解、探索及研究寄生蟲學最有利的工具之一。運用蛋白質(zhì)組學可以研究提供寄生蟲生活史不同階段的發(fā)育蛋白圖譜、細胞圖譜和蛋白質(zhì)功能，為寄生蟲藥物治療和疫苗研究提供新靶點和候選物質(zhì)。雙向凝膠電泳（two－dimensional gel electrophoresis，2－DE）是目前常用的一種能夠連續(xù)在一塊膠上分離數(shù)千種蛋白質(zhì)的方法，廣泛的應用于生物學研究的各個方面［7］。而且各種蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的建立，蛋白質(zhì)組學研究獲得了廣泛和快速的發(fā)展，不僅能為生命活動規(guī)律提供物質(zhì)基礎(chǔ)，也能為許多系統(tǒng)疾病機理的闡明及攻克提供理論根據(jù)和解決途徑［8－10］。

廣州管圓線蟲能夠侵入人體神經(jīng)系統(tǒng)致病，對人類造成極大危害。在此次實驗中，我們采用與人類關(guān)系最密切的廣州管圓線蟲Ⅴ期幼蟲作為研究對象，首先，在樣品的制備過程中盡可能解聚蛋白和擴大其溶解度，提高分辨率，常用方法是化學法和機械裂解法相結(jié)合。我們采取加入裂解液進行研磨、反復凍融的方法制備可溶性蛋白，同時注意溫度控制和避免使用對蛋白有影響的化學制劑；其次，在電泳的各個環(huán)節(jié)中，其影響因素較多，比如蛋白樣品的上樣量、還原劑的濃度、聚焦電壓的控制、染色方法等［11］。其中，膠條pH 的選擇非常重要，目前有許多pH范圍的膠條，首先選擇寬范圍的膠條如pH3～10，其分離的蛋白范圍較大，但寬范圍的膠條是否適合實驗樣本，需根據(jù)具體情況采用不同范圍膠條電泳后進行比較分析。窄范圍的膠條如pH4～7雖然分離蛋白的范圍相對較小，但各蛋白點間距較大，切膠容易，在相同的pH范圍內(nèi)可檢測到更多的蛋白點。因此，我們采用不同pH的膠條（分別為pH3～10和pH4～7）對制備的廣州管圓線蟲Ⅴ期幼蟲的蛋白質(zhì)進行雙向電泳分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用pH3～10的膠條進行雙向電泳，蛋白質(zhì)點分布較集中但各蛋白點間間距較?。欢鴓H4～7的膠條進行的雙向電泳分辨率較高，蛋白點為719個，且蛋白分布均一，其分離的各蛋白點間距相對較大，避免了高豐度掩蓋了低豐度蛋白點，在相同的pH范圍內(nèi)，檢測到的蛋白點更多，靈敏度更高。因此，選擇pH4～7的IPG膠條分離廣州管圓線蟲Ⅴ期幼蟲蛋白較為理想。高濃度還原劑DTT也能影響2－DE的結(jié)果，會造成等點聚焦不充分，蛋白質(zhì)不能有效分離［11］。此次實驗選取水化液DTT濃度為15mmol/L，得到的分離效果相對較好，各蛋白點清晰可見。此外，若蛋白上樣量過大，各蛋白點顯得大、濃，相鄰點蛋白濃度過高而重疊，而且可能會出現(xiàn)水平條紋或拖尾現(xiàn)象。本實驗中用200μg蛋白上樣量分離的蛋白點比較清晰。在染色方法中，銀染可檢出凝膠上0.1～0.5ng的蛋白質(zhì)，比普通考馬斯亮藍染色法靈敏度高50～100倍［11］。我們運用銀染方法，檢測出719個蛋白點。第三，我們也考慮到二維電泳的重復性問題，在控制上樣量、選擇合適pH值的IPG膠條、固定各項參數(shù)后，重復實驗顯示，該實驗方法具有較高的重復性和穩(wěn)定性。

本實驗篩選出pH4～7范圍內(nèi)廣州管圓線蟲的蛋白質(zhì)點分離較好，初步建立了廣州管圓線蟲Ⅴ期幼蟲蛋白質(zhì)組的雙向電泳凝膠圖譜，為進一步進行廣州管圓線蟲蛋白質(zhì)組學分析研究提供了實驗參考。利用蛋白質(zhì)組學尋找差異表達的蛋白可能為由廣州管圓線蟲引起的疾病的藥物研究提供靶標和候選疫苗分子。但是，其詳細機制需要進一步的研究。

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