李 鵬，宋楠楠，岳盈盈，李志會，張 穎，蓋中濤，孟 紅

腸道病毒71型（Enterovirus 71，EV71）是引起嬰幼兒手足口?。℉and Foot and Mouth Disease，HFMD）的主要病原之一，其感染可導致部分患者無菌性腦膜炎、腦干腦炎、神經(jīng)源性肺水腫、脊髓灰質(zhì)炎樣癱瘓等神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，死亡率較高［1］。我國2008年安徽阜陽出現(xiàn)EV71手足口病暴發(fā)，近幾年各地的手足口病疫情不斷加?。?］。目前重癥EV71手足口病的嗜神經(jīng)性致病機制仍不明確，EV71毒力決定因子也未確定，給EV71的防治帶來很大困難。為探討序列變異對EV71流行和毒力變化的影響及目前濟南流行株的遺傳學背景，本研究對濟南市兩株分別源自輕癥和重癥手足口病人的EV71分離株進行全基因組序列的測定和比較分析，為EV71致病機制和嗜神經(jīng)性毒力位點的研究提供參考。

1 材料與方法

1．1 毒株 EV71JN200803株，分離自2008年濟南市傳染病醫(yī)院僅患有皮疹的手足口病患者糞便標本，接種1日齡BALB／c小鼠無明顯臨床癥狀；EV71JN200804株，分離自2008年濟南市傳染病醫(yī)院患有無菌性腦膜炎手足口病患者的糞便標本，接種1日齡BALB／c小鼠可導致后肢麻痹，死亡。

1．2 試劑 RNA提取采用德國QIAGEN公司病毒RNA提取試劑盒（QIAamp Viral RNA Mini Kit），cDNA第一鏈合成試劑盒（QuantScript RT Kit）、高保真DNA聚合酶（Pfu DNA Polymerase）及凝膠DNA回收試劑盒（TIANgel Midi Purification Kit）均購自天根生化科技（北京）有限公司。

1．3 引物 根據(jù)EV71安徽阜陽株（EU703812）并參考BrCr株全基因組序列，利用Primer5．0設(shè)計擴增EV71全基因組核苷酸序列引物，9對引物首尾相互重疊、覆蓋全基因組，見表1。

表1 PCR擴增用引物序列Tab．1 Primers used in PCR amplification

1．4 病毒總RNA的提取 把EV71JN200803、JN200804株經(jīng)MA104細胞擴增得到的細胞培養(yǎng)物反復凍融3次，12 000g離心5min，取上清液140μL按RNA提取試劑盒的說明書進行操作。

1．5 RT－PCR 采用cDNA第一鏈合成試劑盒，將病毒總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，取逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物于25μL反應(yīng)體系中進行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：94℃3min；94℃30s，N 30s，72℃1min，40 Cycles（N為退火溫度，各引物不同）；72℃10min。PCR擴增的特異性片段經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，回收后送公司測序、拼接。

1．6 全基因組序列的比對 采用clustalx1．83對EV71JN200803和JN200804的核苷酸和氨基酸序列進行比對，找出兩株病毒在核苷酸和氨基酸序列上的差異。

1．7 非編碼區(qū)的二級結(jié)構(gòu)分析 采用RNAstructure5．3對EV71JN200803和JN200804株5′UTR和3′UTR的二級結(jié)構(gòu)進行預測，并對其差異進行分析。

1．8 遺傳進化分析 采用 MEGA5．05軟件對EV71JN200803和JN200804株進行遺傳進化分析，將其與國內(nèi)外各型EV71毒株的發(fā)育關(guān)系進行研究。

2 結(jié) 果

2．1 全基因組序列測定分析 不包含多聚腺苷酸尾EV71JN200803株全基因組長度為7 405nt，EV71JN200804株全基因組長度為7 404nt。JN200803株 5′端非編碼區(qū)（5′UTR）為 742nt，JN200804株為741nt；兩毒株基因組編碼區(qū)均為6582nt，編碼2193個氨基酸的多聚蛋白（Polyprotein）；3′端非編碼區(qū)（3′UTR）均為81nt。JN200803和JN200804株病毒基因組的組成和結(jié)構(gòu)均符合EV71的特征。測定的全基因組序列已上傳至GENEBANK，EV71JN200803和JN200804株的序列登記號分別為：JF913464和HQ825317。

2．2 兩株EV71核苷酸和氨基酸序列差異分析EV71JN200803和JN200804株非編碼區(qū)核苷酸序列比較發(fā)現(xiàn)，5′UTR共有7個核苷酸的差異，除99位JN200804株缺失1個胞嘧啶核苷酸（C）外，其余6個均為核苷酸的轉(zhuǎn)換；3′UTR只有7347位1個核苷酸的發(fā)生轉(zhuǎn)換，見表2。EV71JN200803和JN200804株編碼區(qū)核苷酸及氨基酸序列比較發(fā)現(xiàn)，二者在編碼區(qū)沒有核苷酸的缺失和插入，共有98個核苷酸的差異，且突變類型全都屬于轉(zhuǎn)換，但大部分核苷酸的突變屬于同義突變，僅有16個造成了氨基酸的改變；16個突變氨基酸的分布為，VP3 3個，VP1 1個，2A1 個，2B3 個，2C4 個 ，3C2 個 ，3D2個，而VP4、VP2、3A和3B氨基酸沒有發(fā)生突變，表3。

表2 兩株EV71非編碼區(qū)序列比較結(jié)果Tab．2 Comparision of noncoding regions in JN200803 and JN200804

表3 兩株EV71編碼區(qū)序列比較結(jié)果Tab．3 Comparision of the coding regions in JN200803and JN200804

2．3 兩株EV71非編碼區(qū)二級結(jié)構(gòu)差異分析EV71 5′UTR第453～561位堿基（BrCr株堿基位置）區(qū)與脊髓灰質(zhì)炎病毒的內(nèi)部核糖體進入位點（internal ribosome entry site，IRES）第Ⅵ結(jié)構(gòu)域相對應(yīng)，該區(qū)被認為同脊髓灰質(zhì)炎病毒（poliovirus）的毒力密切相關(guān)［3］。然而EV71JN200803和JN200804株在此區(qū)核苷酸序列完全相同，表明造成二者毒力差別的毒力決定位點可能并不在5′UTR。采用RNAStructure5．3對3′UTR進行了RNA二級結(jié)構(gòu)預測。從圖1可以看到EV71JN200803和JN200804株二級結(jié)構(gòu)僅3′UTR第23位（基因組7347位）與第52位（基因組7376位）堿基配對有差異，JN200803的 G－T不能形成穩(wěn)定的配對，而JN200804的A－T的配對很穩(wěn)定。JN200804株形成二級結(jié)構(gòu)所需自由能低于JN200803株，毒力較強的JN200804株的二級結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。

圖1 JN200803和JN200804株3′UTR二級結(jié)構(gòu)預測Fig．1 Computer－predicted secondary structures of EV71 3′UTR of JN200803and JN200804Note：ΔG of JN200803and JN200804were﹣25．4 kcal／mol and﹣25．8kcal／mol，respectively

2．4 兩株EV71的遺傳進化分析 采用MEGA5．05軟件，通過鄰接法（Neighbor－joining），以柯薩奇病毒A16型（coxsackievirus A16，CVA16）為外群，對EV71JN200803、JN200804及GenBank中各亞型EV71的VP1及全基因組核苷酸序列進行遺傳進化分析（圖2，圖3）?？梢奐N200803和JN200804株與Fuyang／17．08／1株進化關(guān)系最近，同屬于C4基因亞型的C4a進化分支。2008年國內(nèi)主要的EV71流行株進化關(guān)系非常密切，與國外EV71毒株進化關(guān)系較遠。

3 討 論

圖2 EV71VP1區(qū)的遺傳進化分析Fig．2 Phylogenetic tree of VPl regions in EV71

圖3 EV71全基因組核苷酸序列的遺傳進化分析Fig．3 Phylogenetic tree of complete genomic nucleotide sequences in EV71

EV71進化過程中的基因突變是造成毒力改變的主要因素之一。McMinn等［4］發(fā)現(xiàn)EV71澳大利亞流行株中只表現(xiàn)HFMD與具有神經(jīng)毒性分離株的主要區(qū)別在于VP1第170氨基酸從丙氨酸（Ala）突變 為 纈 氨 酸 （Val）。Fujimoto 等［5］發(fā) 現(xiàn) 日 本Hyogo地區(qū)表現(xiàn)為腦干腦炎EV71毒株的VP4基因序列均一致，與表現(xiàn)為手足口病EV71毒株有較大差異。Shih等［6］比較了致死和非致死病例感染的EV71的基因組全序列，發(fā)現(xiàn)非結(jié)構(gòu)蛋白3C區(qū)域的核苷酸序列存在較大差異。Chang等［7］對中國6株不同毒力EV71分離株全基因組序列分析發(fā)現(xiàn)，3株臨床輕癥分離株與3株臨床重癥分離株唯一相同的差別是第1994位氨基酸（3D區(qū)）由纈氨酸（Val）突變?yōu)楫惲涟彼幔↖le）。Wang等［8］將實驗鼠感染不致病EV71毒株4643與具有神經(jīng)嗜性突變毒株MP4進行全基因組序列分析，結(jié)果MP4 5′UTR區(qū)有4個核苷酸突變。

本文兩株不同毒力EV71的全基因組序列比較發(fā)現(xiàn)，編碼區(qū)有16個氨基酸發(fā)生了突變，其中VP3 3個，VP1 1個，2A1個，2B3個，2C4個，3C2個，3D2個，而VP4、VP2、3A和3B氨基酸未發(fā)生突變。其中3D區(qū)的突變與中國其他省EV71輕重株（重株：安徽1株、河南2株，輕株：重慶3株）氨基酸突變不同［7］，JN200803和JN200804株第1994位氨基酸均為異亮氨酸（Ile），與重慶的3株輕株相同。VP3、2A、2B和2C區(qū)雖然在已有報道中不是常見的毒力決定區(qū)域，但也可能存在對病毒毒力有影響的位點，Whitton等［9］發(fā)現(xiàn)脊髓灰質(zhì)炎病毒VP3第91位氨基酸對病毒致病性具有重要意義。因而EV71毒力決定位點不但具有非單一性，而且具有明顯的區(qū)域獨特性，與當?shù)氐牧餍刑攸c密切相關(guān)。

小 RNA 病毒科 （picornaviridae）病 毒 的5′UTR有一個與翻譯密切相關(guān)的IRES，EV71與脊髓灰質(zhì)炎病毒的IRES為同一類型，結(jié)構(gòu)與功能極為相似［10］。脊髓灰質(zhì)炎病毒IRES的第Ⅵ結(jié)構(gòu)域被認為與其毒力密切相關(guān)，而JN200803和JN200804株在此區(qū)域核苷酸序列完全相同，可見EV71濟南分離株的毒力決定位點可能不在5′UTR。EV71 3′UTR被認為與病毒負鏈合成相關(guān)，對病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復制有重要的調(diào)控作用，而EV71 JN200803和JN200804株3′UTR只有一個核苷酸的不同，分析發(fā)現(xiàn)JN200804株的二級結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，對病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復制更為有利。

通常認為VPl區(qū)全長核苷酸序列分析可作為腸道病毒屬血清型分類的依據(jù)［11］。本文將EV71濟南分離株與2008年國內(nèi)主要流行株及其他亞型EV71進行了VP1和全基因組遺傳進化分析，發(fā)現(xiàn)兩株EV71濟南分離株同屬C4亞型的C4a進化分支，與Fuyang／17．08／1株進化關(guān)系最近，應(yīng)具有共同的起源。另外，中國大陸1998年以來的EV71毒株均為C4亞型，2008年的分離株均為C4亞型的C4a進化分支；與國外病毒株相比，中國大陸EV71分離株與中國臺灣分離株的親緣關(guān)系更近?？傊?，對相同疫源中不同毒力EV71分離株（EV71 JN200803和JN200804株）的全基因組序列進行比較，發(fā)現(xiàn)潛在的毒力決定位點，分析EV71的變異情況和流行特點，對EV71手足口病的防治具有重要意義。

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