陳 哲，鄭玉玲，郝淮杰，律清宇，任志強(qiáng)，王 濤，姜永強(qiáng)，呂淑霞

豬鏈球菌血清2型（Streptococcus suis serotype 2，Ss2）是一個(gè)重要的新發(fā)病原體，不僅能夠感染動(dòng)物，引起腦膜炎、敗血癥、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎等，還能感染人，引起腦膜炎、鏈球菌中毒性休克樣綜合征等。1998年和2005年，我國先后暴發(fā)了2次比較大規(guī)模的流行，共造成200多人感染，50多人死亡［1］，對(duì)豬的產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)帶來了巨大的損失，引起了世界范圍內(nèi)的關(guān)注［2］。但目前其致病機(jī)制還不是很清楚［3］。

細(xì)菌的表面蛋白和分泌蛋白在細(xì)菌感染中起重要作用。理論上，表面蛋白的抗原能夠有效的提高免疫應(yīng)答的效率，可作為疫苗的重要組成成分［4］。我們?cè)谇捌诿庖叩鞍踪|(zhì)組研究中，發(fā)現(xiàn)SSU05＿0272蛋白為潛在的毒力因子和保護(hù)性表面蛋白，但其生物學(xué)功能還不清楚。本研究旨在構(gòu)建SSU05＿0272基因的重組表達(dá)質(zhì)粒，獲得高純度蛋白，并研究其對(duì)細(xì)胞因子的調(diào)控功能。

1 材料與方法

1．1 材料BamHI、Xho I內(nèi)切酶，Taq DNA聚合酶，IPTG，大腸桿菌DH5（感受態(tài)細(xì)胞購自TaKaRa公司；BL21（DE3）購自天根公司；T4DNA連接酶，pCR○R2．1 載 體，RNA 提 取 試 劑 盒 （PureLinkTMRNA Mini kit）、SYBR Green染料購自Invitrogen公司；pET－28a（＋）表達(dá)載體購自 Novagen公司；質(zhì)粒DNA提取試劑盒及膠回收試劑盒購自東盛公司；PCR 引物（0272／PF：5′－GTT GGA TCC GAA TCG CTA GAA C－3′，0272／PR：5′－TAT CTC GAG TCA ACT TGC TTC GCC TG－3′）由上海生工生物工程有限公司合成；Ni－NTA agarose、Hi－Trap Q HP購自GE公司；《顯色基質(zhì)鱟試劑盒》購自廈門市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司；EBM－2（lonza）購自北京澤平科技責(zé)任有限公司；胎牛血清（BD）；QuantiTect Reverse Transcription Handbook反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自QIAGEN公司，人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系hCMEC／D3由法國P－O Couraud教授惠贈(zèng)。

1．2 方法

1．2．1 細(xì)胞培養(yǎng) 人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系hCMEC／D3由法國國家醫(yī)學(xué)衛(wèi)生研究院（INSERM）的Pierre－Olivier Couraud教授惠贈(zèng)。人BMEC細(xì)胞系hCMEC／D3培養(yǎng)基為：EBM－2中加入如下成分：FBS（5%），氫化可的松（1．4μmol／L），抗壞血酸（5 μg／mL），化學(xué)成分確定脂溶液（1／100），HEPES（10 mM），bFGF（1ng／mL），青霉素（100U／mL），鏈霉素（100U／mL）。培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板用0．01%的鼠尾膠原溶液按6～10μg／cm2的量37℃包被數(shù)小時(shí)，去除多余液體，過夜干燥，用無菌組織培養(yǎng)基水漂洗后，接種hCMEC／D3細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。

1．2．2 SSU05＿0272重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 以豬鏈球菌05ZYH33基因組為模版，以0272／PF、0272／PR為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增SSU05＿0272基因。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性7min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸150s，32個(gè)循環(huán)；擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10g／L瓊脂糖電泳后按照DNA膠回收試劑盒的操作步驟純化回收擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物經(jīng)TA克隆連接至pCR○R2．1載體，轉(zhuǎn)化至E．coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，挑取白色菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定。陽性克隆質(zhì)粒經(jīng)BamH I和Xho I酶切后連接到表達(dá)載體pET28a（＋），并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）中。質(zhì)粒提取后，進(jìn)行酶切和測(cè)序鑒定。

1．2．3 SSU05＿0272蛋白的表達(dá) 將含有重組蛋白基因表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌BL21（DE3）接種到卡那霉素抗性（50μg／mL）的LB培養(yǎng)基中，30℃水浴振蕩培養(yǎng)至A600為0．4左右，加入IPTG（終濃度1 mmol／L）繼續(xù)培養(yǎng)6．5h，離心集菌，進(jìn)行 SDSPAGE電泳分析結(jié)果。

1．2．4 SSU05＿0272蛋白的純化 將離心后沉淀用buffer A（5mmol／L PB，pH7．0）重懸，超聲破菌，確定為上清表達(dá)，離心棄沉淀，0．45μm濾膜抽濾，buffer B（5mmol／L PB，pH7．0，0．5mol／L NaCl，5mmol／L咪唑）稀釋后上樣于經(jīng)buffer B平衡過的Ni－NTA agarose柱。上樣結(jié)束后buffer C（5mmol／L PB，0．5mol／L NaCl，0．5mol／L咪唑）進(jìn)行梯度洗脫。純化出的蛋白透析后經(jīng)A液（5 mmol／L PB，pH7．0，0．5mol／L NaCl）稀釋，上樣于經(jīng)A液平衡過的HiTrap Q HP柱。上樣結(jié)束后，B液（5mmol／L PB，pH7．0）進(jìn)行梯度洗脫，SDSPAGE鑒定蛋白純度。

1．2．5 Triton X－114 抽提重組 SSU05＿0272蛋白中LPS Triton X－114以1%比例加入到純化后的蛋白中，混勻后4℃放置30min，37℃ 水浴10 min，25℃20 000g離心10min，收集上清。

1．2．6 鱟試劑檢測(cè)重組SSU05＿0272蛋白中的LPS含量 按照《顯色基質(zhì)鱟試劑盒》（廈門市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司）說明書的操作步驟對(duì)SSU05＿0272蛋白中LPS的含量進(jìn)行檢測(cè)。

1．2．7 RT－PCR檢測(cè)SSU05＿0272蛋白與人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞作用后細(xì)胞因子的變化 人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系hCMEC／D3經(jīng)0．25%胰酶消化后3×105個(gè)／mL接種于0．01%的鼠尾膠原（6－10μg／cm2）包被過的6孔板中，細(xì)胞生長(zhǎng)至單層后無菌PBS洗一次，每孔加入500ng／mL的細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋的SSU05＿0272蛋白，分別作用0h、1h、3h、6h后，利用Invitrogen PureLinkTMRNA Mini kit提取總RNA，NanoDrop 2000進(jìn)行核酸定量，瓊脂糖電泳判定純度。按照QIAGEN公司的QuantiTect Reverse Transcription Handbook說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。采用SYBR Green法進(jìn)行RT－PCR檢測(cè)。程序?yàn)椋?5℃激活HotStar DNA聚合酶2min，運(yùn)行40個(gè)循環(huán)，循環(huán)條件為：95℃變性15s，60℃退火60s，退火步驟進(jìn)行熒光采集。以β－actin為參考基因，用2AACt方法進(jìn)行不同條件下基因的相對(duì)定量。引物序列見表1。

表1 細(xì)胞因子的引物序列Tab．1 The sequences of cytokine primers

1．3 數(shù)據(jù)處理 EXCEL2003建立數(shù)據(jù)庫，Graph－Pad Prism 5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量單位采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2．1 SSU05＿0272重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定以05ZYH33基因組為模版，0272／PF、0272／PR進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，得到大小為1 932bp的目的片段，見圖1。將該基因片段回收后經(jīng)TA克隆連接到PCR○R

2．2 載體，挑取陽性克隆經(jīng)雙酶切鑒定后成功連接到表達(dá)載體pET－28a（＋）上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞后，挑取陽性克隆進(jìn)行PCR鑒定，BamH I和Xho I雙酶切鑒定，見圖2。及測(cè)序結(jié)果顯示，得到的重組質(zhì)粒與預(yù)期一致。

圖1 SSU05＿0272基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳Fig．1 SDS－PAGE on PCR product of SSU05＿0272geneM：DNA marker；1：SSU05＿0272基因擴(kuò)增片段

2．3 SSU05＿0272的表達(dá)純化 將含有SSU05＿0272基因的大腸桿菌誘導(dǎo)后離心集菌，超聲破碎后行SDS－PAGE電泳，確定為上清表達(dá)。稀釋上清后，經(jīng)過鎳親和層析和陰離子交換層析純化后，得到重組的純化蛋白。經(jīng)SDS－PAGE電泳鑒定純化后的蛋白純度在90%以上，見圖3。

圖2 SSU05＿0272－pET28a（＋）重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定Fig．2 Restriction endonuclease digestion of the recombinant expression plasmid SSU05＿0272－pET28a（＋）M：DNA marker；1：質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物

圖3 SDS－PAGE電泳檢測(cè)重組蛋白的純化Fig．3 SDS－PAGE of the purified recombinant proteinM：蛋白 marker；1：SSU05＿0272蛋白

2．4 Triton X－114 抽提重組SSU05＿0272蛋白中LPS 用Triton X－114法對(duì)純化后的SSU05＿0272蛋白中的LPS進(jìn)行抽提，離心后獲得的上清即為目的蛋白。

2．5 鱟試劑檢測(cè)重組SSU05＿0272蛋白中LPS的含量 《顯色基質(zhì)鱟試劑盒》檢測(cè)結(jié)果顯示，最后獲得的SSU05＿0272重組蛋白中LPS含量＜0．03 EU／mL，符合國家標(biāo)準(zhǔn)。

2．6 SSU05＿0272蛋白與人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞作用后細(xì)胞因子變化的RT－PCR檢測(cè) 終濃度500 ng／mL的SSU05＿0272蛋白與人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞分別作用0h、1h、3h、6h后，提取細(xì)胞的總RNA，NanoDrop 2000進(jìn)行核酸定量后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。SYBR Green法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，SSU05＿0272蛋白能夠上調(diào)IL－6、IL－8、TNF－α、IL－1β的表達(dá)（P＜0．05），下調(diào)IL－12P40的表達(dá)（P＜0．01），而不影響IL－12P70的表達(dá)，圖4。

圖4 SSU05＿0272蛋白與hCMEC／D3作用后細(xì)胞因子的變化情況Fig．4 The transcriptional level changes of cytokine after the interaction of SSU05＿0272protein and hCMEC／D3

3 討 論

SSU05＿0272作為一個(gè)細(xì)胞壁蛋白，被命名為翻譯起始因子GTP酶，是一個(gè)具有免疫原性的細(xì)胞壁蛋白［5］，其抗血清蛋白可以促進(jìn)鏈球菌的殺傷［6］。SDS－PAGE 結(jié) 果 顯 示，純 化 得 到 的 重 組SSU05＿0272蛋白大小在130kDa左右，而其理論的分子量是74．3kDa，這與之前的報(bào)道一致［7］。在重組表達(dá)純化蛋白方面，雖然國內(nèi)外有文獻(xiàn)報(bào)道，但本研究采用了不同的純化方式，得到了純度更高的蛋白［8］。

豬鏈球菌在同BMEC細(xì)胞相互作用過程中，能誘發(fā)BMEC分泌細(xì)胞因子。Vadeboncoeur等發(fā)現(xiàn)豬鏈球菌與hBMEC的黏附能誘導(dǎo)產(chǎn)生IL－6、IL－8等促炎癥因子，IL－6能介導(dǎo)多種免疫反應(yīng)，在腦膜炎病人的腦脊液中含量升高，可能為豬鏈球菌誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞因子從而改變BBB的通透性提供了前提條件［9］。IL－1β是一個(gè)重要的促炎癥因子，在豬鏈球菌感染中表達(dá)上調(diào)。IL－1β在細(xì)菌性腦膜炎致病中有重要作用，其通過刺激其他細(xì)胞因子如IL－8，IL－6和 GM－CSF的產(chǎn)生來介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，同時(shí)其還能上調(diào)細(xì)胞粘附分子ICAM－1和BBB的通透性［10］。Vanier等發(fā)現(xiàn)豬鏈球菌活菌能刺激pBMEC分泌IL－6和IL－8，這種刺激主要是同豬溶血素有關(guān)，但細(xì)胞壁成分也一定程度的有助于細(xì)胞刺激［11］。實(shí)時(shí)定量 PCR 顯示，SSU05＿0272在體內(nèi)的表達(dá)有明顯的提高［12］，我們的研究顯示，SSU05＿0272蛋白與人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞作用后IL－6、IL－8、TNF－α、IL－1β表達(dá)上調(diào)，IL－12P40表達(dá)下調(diào)，這在國內(nèi)外還未見報(bào)道，提示其可能與促炎癥有關(guān)。

［1］Huang YT，Teng LJ，Ho SW，et al．Streptococcus suis infection［J］．Microbiol Immunol Infect 2005，38（5）：306－13．

［2］Lun ZR，Wang QP，Chen XG，et al．Streptococcus suis：an emerging zoonotic pathogen［J］．Lancet Infect Dis，2007，7（3）：201－9．

［3］Gottschalk M，Xu J，Calzas C，et al．Streptococcus suis：a new emerging or an old neglected zoonotic pathogen［J］．Future Microbiol，2010，5（3）；371－391．

［4］Francesca Mandanici，Lidia G mez－Gasc n，et al．A surface protein of Streptococcus suis serotype 2identified by proteomics protects mice against infection［J］．Journal of proteomics，2010：2365－2369．

［5］Annika K，Sauli H，Vuokko L，et al．Identification of a Novel Streptococcaladhesin p（SadP）protein recognizing galactosy l－1 4－galactose－containing glycoconjugates［J］．J Biol vol，2011，286（45）；38854－38864．

［6］Geng H，Zhu L，Yuan Y，et al．Identification and characterization of novel immunogenic proteins of Streptococcus suis serotype 2［J］．J Proteome Res，2008，7：4132－42．

［7］Li Y，Martinez G，Gottschalk M，et al．Identification of a surface protein of Streptococcus suis and evaluation of its immunogenic and protective capacity in pigs［J］．Infect Immun，2006，74：305－312．

［8］律清宇，陳哲，鄭玉玲，等．2型豬鏈球菌細(xì)胞壁蛋白SSU1664的表達(dá)、純化及活性分析［J］．細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2011，27（7）：757－759．

［9］Vadeboncoeur N，Segura M，Al－Numani D，et al．Pro－inflammatory cytokine and chemokine release by human brain microvascular endothelial cells stimulated by Streptococcus suis serotype 2［J］．FEMS Immunol Med Microbiol，2003，35（1）；49－58．

［10］Leib SL，Tauber MG．Pathogenesis of bacterial meningitis［J］．Infect Dis Clin North Am，1999Sep，13（3）；527－48，v－vi．

［11］Vanier G，Segura M，Lecours MP，et al．Porcine brain microvascular endothelial cell－derived interleukin－8is first induced and then degraded by Streptococcus suis［J］．Microb Pathog，2009，46（3）：135－43．

［12］Chen B，Zhang A，Li R，et al．Evaluation of the protective efficacy of a newly identifed immunogenic protein，HP0272，of Streptococcus suis［J］．FEMS Microbiol Letters，2010，1：1－7．