李桂蓮 張敬蕊 趙秀芹 楊驁 連璐璐 萬康林

INH和RFP是兩種最主要的一線抗結(jié)核藥之一，對(duì)這兩種藥物耐藥機(jī)制的研究日益受到重視。文獻(xiàn)報(bào)道Mtb對(duì)INH耐藥性的產(chǎn)生與過氧化氫酶－過氧化物酶編碼基因katG的缺失和突變及烯?；€原酶編碼基因inh A 和oxy R－ahpC（oxy R，烷烴降解非必需基因，編碼過氧化物反應(yīng)調(diào)節(jié)子；ahp C編碼烷基過氧化氫還原酶）基因突變有關(guān)［1－5］。RFP耐藥性的產(chǎn)生與RNA聚合酶β亞基的編碼基因rpo B突變有關(guān)，文獻(xiàn)報(bào)道90%以上的RFP耐藥株在rpo B基因81個(gè)堿基的核心區(qū)域（編碼507－533位密碼子）－RFP耐藥決定區(qū)（rifampicin resistance－determining region，RRDR）發(fā)生突變［1，6－7］。

目前，關(guān)于Mtb基因突變的報(bào)道較多，而最低抑菌濃度（MIC）與突變位點(diǎn)之間的關(guān)系雖然早有研究，但由于檢測(cè)抗Mtb藥物的MIC對(duì)生物安全要求較高，國內(nèi)關(guān)于菌株對(duì)抗Mtb藥物的MIC與基因突變關(guān)系的研究報(bào)道較少，現(xiàn)將關(guān)于Mtb對(duì)INH的MIC與katG、inh A和oxy R－ahpC 突變及RFP的MIC與rpo B基因突變關(guān)系的研究報(bào)道如下。

材料和方法

一、菌株

Mtb標(biāo)準(zhǔn)株（H37Rv，ATCC27294）和75株經(jīng)菌種鑒定為Mtb的臨床分離株，包括13株同時(shí)耐INH和RFP（耐多藥菌株，指菌株至少同時(shí)對(duì)INH和RFP耐藥），1株同時(shí)耐INH、RFP、S和左氧氟沙星（耐多藥菌株），16株單耐 RFP，40株單耐INH，3株同時(shí)耐INH和S，1株同時(shí)耐INH和EMB，1株同時(shí)耐INH和左氧氟沙星的菌株，以上菌株均為本室保存。75株菌株中耐INH菌株共59株，耐RFP菌株共30株。對(duì)所有耐INH的菌株檢測(cè)INH MIC并PCR測(cè)序檢測(cè)katG、inh A和oxy R－ahp C基因的突變情況，對(duì)所有耐RFP的菌株檢測(cè)RFP MIC并PCR測(cè)序檢測(cè)rpoB基因的突變情況。

二、試劑和耗材

Middlebrook 7 H9干粉和牛血清蛋白－右旋糖苷－過氧化氫酶（ADC）營養(yǎng)添加劑購自美國BD公司；RFP、INH、S、EMB、左氧氟沙星、卷曲霉素、阿米卡星和Km等藥粉購自美國Sigma公司；Alamar blue試劑購自美國AbD Serotec公司；無菌96孔酶標(biāo)板購自美國Corning公司；PCR檢測(cè)試劑購自北京康為生物技術(shù)有限公司。

三、羅氏培養(yǎng)基比例法藥物敏感度實(shí)驗(yàn)

按照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》［8］進(jìn)行，培養(yǎng)基中藥物終濃度如下：RFP 40μg/ml，INH 0.2μg/ml，S 4μg/ml，EMB 2μg/ml，卡那霉素30μg/ml，左氧氟沙星3μg/ml，卷曲霉素40μg/ml，阿米卡星30μg/ml［8－9］。

四、微孔板Alamar blue顯色法MIC測(cè)定

在磨菌管內(nèi)加入1～2滴5%吐溫－80（Tween－80），取2～3周Mtb新鮮培養(yǎng)物，加入4～5 ml生理鹽水并混勻；靜置5～10 min；取適量上清到25 ml培養(yǎng)瓶中，用生理鹽水調(diào)節(jié)濃度至1個(gè)麥?zhǔn)蠞舛龋话凑?0%的比例在7H9溶液中加入ADC；再取1個(gè)25 ml培養(yǎng)瓶，按1∶20比例用7 H9培養(yǎng)基稀釋4 ml菌液；在96孔板中每孔加入100μl 7 H9培養(yǎng)基，第1列再加入98μl培養(yǎng)基；第1列每孔加入2μl RFP（51.2 mg/ml）或INH（25.6 mg/ml）貯存液；按照2倍稀釋原則依次稀釋，至第11列，得到從256.0000～0.2500μg/ml或128.0000～0.1250μg/ml的藥液梯度，最后一列為空白；每株菌接種一行，每孔加入100μl稀釋菌液；另做一塊空白板（不含藥），每孔加入100μl 7H9培養(yǎng)基和100μl稀釋菌液，每株菌加4個(gè)孔；酶標(biāo)板第一行和最后一行加樣孔滴加生理鹽水以防干燥，用封口膜密封酶標(biāo)板；在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d；從第6天開始，在空白板中加入70μl顯色劑（Alamar blue∶5%Tween－80＝2∶5），隔天觀察變色情況。如顏色從藍(lán)色變成紫紅色或粉色，則在含藥培養(yǎng)基中加入顯色劑；若沒有變色或變色程度較淺，則繼續(xù)在另一對(duì)照孔中加入顯色劑，觀察至變色為止。在含藥培養(yǎng)基中加入顯色劑的第2天，觀察結(jié)果。對(duì)RFP MIC等于0.5000μg/ml和INH MIC等于0.2500μg/ml的菌株，進(jìn)行低濃度的藥物濃度梯度稀釋，RFP按1.0000～0.0010μg/ml的2倍系列稀釋；INH按0.5000～0.0005μg/ml的2倍系列稀釋。MIC定義為藍(lán)色完全沒有發(fā)生改變的最小藥物濃度。

五、Mtb基因組提取和PCR測(cè)序

Mtb基因組提取采用十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法［10］。利用直接測(cè)序法檢測(cè)RFP耐藥相關(guān)基因rpoB，INH耐藥相關(guān)基因katG、inh A和oxy R－ahpC，引物序列參考文獻(xiàn)［3，7，11］，PCR均采用50μl擴(kuò)增體系，反應(yīng)條件均為：94℃變性5 min，然后94℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物直接送到北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行單向測(cè)序，測(cè)序引物為PCR擴(kuò)增用上游引物，測(cè)序儀器為ABI3730自動(dòng)測(cè)序儀。采用生物信息學(xué)軟件DNASTAR Lasergene Editseq 7.1.0和GENtle 1.9.1對(duì)測(cè)序得到的基因序列與H37Rv基因序列進(jìn)行比對(duì)。

六、不同耐藥水平菌株基因突變率的比較

不同耐藥水平菌株基因突變率的比較采用四格表χ2檢驗(yàn)或確切概率法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

結(jié) 果

一、耐藥 Mtb INH 的 MIC及katG、inh A 和oxy R－ahpC突變結(jié)果

59株對(duì)INH耐藥的Mtb其INH的MIC值及katG、inh A和oxy R－ahp C突變結(jié)果見表1。14株耐多藥和5株多耐藥（指菌株對(duì)2種或2種以上抗結(jié)核藥物耐藥但不包括耐多藥）菌株INH的MIC值分布在0.2500～2.0000μg/ml及大于128.0000μg/ml。40株單耐INH 菌株中 MIC分布在0.2500～32.0000μg/ml之間，以2.0000μg/ml為主，占全部單耐INH 菌株的67.5%（27/40）。59株INH耐藥菌株katG、inh A啟動(dòng)子、oxy R－ahp C突變率分別為69.5%（41/59）、15.3%（9/59）、6.8%（4/59），總突變率為81.4%（48/59）。

INH MIC在0.2500～1.0000μg/ml的13株菌株，inh A 啟動(dòng)子突變率為53.8% （7/13），katG 315突變率為15.4% （2/13）；MIC≥2.0000μg/ml的菌株inh A 突變率為4.3% （2/46），而katG 315突變率為76.1% （35/46）。INH 低水平耐藥菌株（MIC為0.2500～1.0000μg/ml）inh A 啟動(dòng)子突變率高于高水平耐藥株（MIC≥2.0000μg/ml）（χ2＝15.57，P＝0.000）；而katG 315位突變率則相反（χ2＝13.48，P＝0.000），結(jié)果見表2。

二、耐藥Mtb菌株RFP MIC及rpo B基因突變結(jié)果

30株對(duì)RFP耐藥的Mtb其RFP MIC值及rpo B基因突變結(jié)果見表3。14株耐多藥菌株MIC值均在0.5000μg/ml及以上，16株單耐RFP菌株中除1株菌株 MIC為2.0000μg/ml，剩余15株MIC值在16.0000μg/ml及以上。30株菌株rpo B基因總突變率為96.7% （29/30），rpo B 531位突變率為70.0%（21/30），包括2種突變形式 TCG突變?yōu)?TTG（20株）、TTC（1株）；rpo B 526位突變率為16.7%（5/30），含3種突變形式 CAC突變?yōu)?CAG（1株）、TAC（1株）、GAC（3株）。其他rpo B 突變類型如516、522、堿基缺失各1株，1株菌株511和526位點(diǎn)形成聯(lián)合突變，1株菌株450、559和531位點(diǎn)形成聯(lián)合突變。

表1 對(duì)INH耐藥的Mtb菌株的INH MIC值及katG、inh A和oxy R－ahp C突變結(jié)果

表2 INH耐藥水平和katG 315、inh A啟動(dòng)子突變的相關(guān)性分析結(jié)果

21株rpo B 531突變株 MIC分布在2.0000 μg/ml和＞256.0000μg/ml之間。5株rpo B 526突變株除了1株 MIC為0.5000μg/ml，其余4株MIC均在64.0000μg/ml及以上。RFP MIC在0.5000～16.0000μg/ml的菌株rpo B 531和526突變率為62.5%（5/8）；MIC≥32.0000μg/ml的菌株rpo B 531和526位點(diǎn)的總突變率為95.5%（21/22），分析發(fā)現(xiàn)RFP MIC≥32.0000μg/ml的菌株rpo B 531和526位點(diǎn)的突變率高于 MIC在0.5000～16.0000μg/ml的菌株，P確切概率＝0.048（表4）。

討 論

一、INH 耐藥水平與katG、inh A 和oxy R－ahp C突變的相關(guān)性

已知和INH耐藥有關(guān)的基因有katG、inh A、oxy R－ahp C、kas A 及ndh［1－5，12］。其中katG 和inh A是最主要的2個(gè)耐藥相關(guān)基因，報(bào)道稱katG和inh A突變分別占INH臨床耐藥株的50%～94%、10%～35%，以katG 315（AGC－ACC）（Ser－Thr）突變 率 最 高［1－2，13］。 而oxy R－ahpC突變率可達(dá)到10.0%～39.6%［3－4］。本研究59株INH 耐藥 Mtb的總突變率為81.3%（48/59），katG、inh A 啟動(dòng)子、ox y R－ahpC 突變率分別為69.5%（41/59）、15.3%（9/59）、6.8%（4/59），總突變率為81.3%（48/59），這和文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。

表3 對(duì)RFP耐藥的Mtb菌株的RFP MIC值及rpoB基因突變結(jié)果

表4 RFP耐藥水平和rpoB突變的相關(guān)性分析結(jié)果

文獻(xiàn)報(bào)道katG 315位突變與菌株對(duì)INH高度耐藥有關(guān)［2］。本研究發(fā)現(xiàn)INH低水平耐藥菌株（MIC為0.2500～1.0000μg/ml）以inh A 啟動(dòng)子突變?yōu)橹?，高水平耐藥菌株（MIC≥2.0000μg/ml）以katG 315位 突 變 為 主。Abe等［14］將 96 株 經(jīng)BACTEC MGIT 960診斷為INH耐藥的菌株利用小川培養(yǎng)基比例法將這些菌株分為3個(gè)等級(jí)：低水平敏感（0.2μg/ml敏感），低水平耐藥（0.2μg/ml耐藥），高水平耐藥（1.0μg/ml耐藥），結(jié)果低水平敏菌株中只有inh A啟動(dòng)子突變而無katG 315突變，低水平耐藥菌株inh A啟動(dòng)子突變率（52.6%）高于katG 315突變率（15.8%），而61.7%的高水平耐藥菌株攜帶katG 315或katG缺失突變。Dalla Costa等［15］也發(fā)現(xiàn) MIC≥2μg/ml（刃天青顯色法）的菌株katG 315突變率更高。本研究和Abe等［14］及Dalla Costa等［15］的研究均證實(shí)了inh A啟動(dòng)子突變與INH低耐藥水平有關(guān)，而katG 315突變與INH高水平耐藥有關(guān)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)6株MIC＞128.0000μg/ml的菌株有3株發(fā)生了oxy R－ahp C突變，提示oxy R－ahp C突變可能與INH高水平耐藥有關(guān)，但應(yīng)該增加樣本含量進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究共4株 MIC在0.2500～1.0000μg/ml的INH耐藥株在katG基因315位點(diǎn)之外的位點(diǎn)發(fā)生突變，其中1株為katG 222 GCG－GAG（Ala－Glu）突變，1株katG 261 GAA－GAC（Glu－Asp）和inh A－15C－T聯(lián)合突變，2株katG 298 TTG－TGG（Leu－Trp）和inh A－15C－T聯(lián)合突變。由于其中有3株菌株與inh A－15C－T聯(lián)合突變，因此這4個(gè)katG基因突變位點(diǎn)和INH低水平耐藥的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。此外，1株 MIC為2.0000μg/ml的菌株為katG 315 和inh A－19 G－A 聯(lián) 合 突 變，inh A－19 和INH耐藥的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

二、RFP耐藥水平與rpo B突變的相關(guān)性

本研究共檢測(cè)了30株RFP耐藥株的rpoB基因突變情況，rpo B總突變率為96.7%，rpo B 531位突變率為 70.0% （21/30），rpoB 526位突變率為16.7%（5/30），和 文 獻(xiàn) 報(bào) 道 一 致［1，5，7，16］。RFP MIC≥32.0000μg/ml的菌株rpo B 531和526位點(diǎn)的突變率高于 MIC在0.5000～16.0000μg/ml的菌株。由此可見rpoB 531和526位基因突變和RFP高水平耐藥有關(guān)［17］。30株菌株中只有3株菌株發(fā)生rpoB 511和516位突變，文獻(xiàn)報(bào)道這2個(gè)位點(diǎn)和 RFP低水平耐藥有關(guān)［18］。Huitric等［17］發(fā)現(xiàn)rpo B基因RRDR區(qū)域除531和526之外還有多個(gè)位點(diǎn)與RFP高水平耐藥有關(guān)，只有522位點(diǎn)與RFP低水平耐藥有關(guān)（MIC 8～16μg/ml）。Hwang等［19］也發(fā)現(xiàn)在rpoB RRDR內(nèi)突變的菌株其 MIC比在RRDR外發(fā)生突變的菌株高。本研究未發(fā)現(xiàn)rpoB 533位基因突變的菌株，但有研究表明該位點(diǎn)與RFP低水平耐藥有關(guān)［18］。

另外，還有16.9%的INH耐藥株和3.3%的RFP耐藥株沒有發(fā)現(xiàn)突變，這可能和本研究所測(cè)基因測(cè)序范圍外的其他突變位點(diǎn)或是與其他耐藥相關(guān)基因突變有關(guān)，如RFP耐藥相關(guān)的rpo B基因的氨基端和羧基端［7，20］、INH 耐藥相關(guān)的ndh［12］等。此外，最近研究還發(fā)現(xiàn)INH和RFP的耐藥還與Mtb藥物外排泵基因Rv1410c和Rv0783的高表達(dá)有關(guān)［21］。

由于本研究耐多藥菌株只有14株，因此分析基因突變與耐藥水平相關(guān)性時(shí)未將兩者結(jié)果分開。但發(fā)現(xiàn)耐多藥或多耐藥菌株與單耐INH或單耐RFP菌株相比，基因突變類型較多，如INH耐藥株中，前者為8種突變類型而后者僅為4種突變類型；在RFP耐藥株中，前者為6種突變類型而后者僅為4種突變類型。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Mtb katG 315位突變和INH高水平耐藥有關(guān)，inh A啟動(dòng)子突變與INH低水平耐藥有關(guān)，oxy R－ahp C間隔區(qū)基因突變可能與INH高水平耐藥有關(guān)，但應(yīng)增加樣本含量進(jìn)一步驗(yàn)證；rpoB 531和526位點(diǎn)突變與RFP高水平耐藥有關(guān)。本研究所得數(shù)據(jù)以及一些新的發(fā)現(xiàn)，為進(jìn)一步研究Mtb對(duì)INH和RFP的耐藥機(jī)制提供了理論依據(jù)，對(duì)于結(jié)核病的治療和控制將起重要作用。

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