王衛(wèi)文 李有武 夏永祥 劉才冬

南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇省南京市 210006

超廣譜β－內(nèi)酰胺酶（extended－spectrumβ－lactamases，ESBLs）是由質(zhì)粒介導(dǎo)可水解含氧亞氨基的β－內(nèi)酰胺類抗生素，并可被β－內(nèi)酰胺酶抑制劑克拉維酸等抑制的一類β－內(nèi)酰胺酶，主要由大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌產(chǎn)生。產(chǎn)ESBLs菌不僅對第三代頭孢菌素和氨曲南耐藥，而且對氨基糖苷類、喹諾酮類、磺胺類抗菌藥物也有交叉耐藥。根據(jù)2001年Bradford的分類，將ESBLs分為TEM型、SHV型、CTX－M型、OXA型及其他型五類［1，2］。為了解南京地區(qū)產(chǎn)ESBLs菌的基因型流行情況，筆者收集了南京地區(qū)四家三級甲等醫(yī)院臨床標(biāo)本中分離的60株產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌分別用TEM型、SHV型、CTX－M型、OXA型ESBLs的特定引物進(jìn)行擴(kuò)增并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序分析，得到南京地區(qū)產(chǎn)ESBLs菌的基因型流行病學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株：30株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌和30株產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌分別分離自江蘇省人民醫(yī)院、南京市鼓樓醫(yī)院、南京市第一醫(yī)院和南京市中大醫(yī)院臨床標(biāo)本，所有菌株均經(jīng)法國生物梅里埃公司ATB Expression自動細(xì)菌鑒定儀重新鑒定，并經(jīng)ESBLs確證試驗(yàn)確定。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922，肺炎克雷伯菌ATCC700603。

1.1.2 藥敏紙片：頭孢噻肟（30μg／片），頭孢他啶（30μg／片），頭孢噻肟／克拉維酸（30μg／10μg），頭孢他啶／克拉維酸（30μg／10μg）以上紙片均為英國Oxoid公司產(chǎn)品。

1.1.3 儀器及試劑：ATB Expression細(xì)菌鑒定及藥敏智能系統(tǒng)，細(xì)菌鑒定試條、M－H瓊脂均為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品。TaqDNA酶、dNTP、PCR純化試劑盒購自上海生工生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 ESBLs確證試驗(yàn)［3］：按照標(biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散法的規(guī)定接種M－H平板，在M－H平板上貼上頭孢噻肟（30μg／片），頭孢噻肟／克拉維酸（30μg／10μg）和頭孢他啶（30μg／片），頭孢他啶／克拉維酸（30μg／10μg）紙片，35℃孵育16～18h，對兩組中任何一個藥物，在加克拉維酸后抑菌圈直徑與不加克拉維酸的抑菌圈直徑相比增大值≥5mm時，判定為產(chǎn)ESBLs菌。

1.2.2 PCR擴(kuò)增：PCR擴(kuò)增用煮沸法提取細(xì)菌DNA，取2μL用于PCR擴(kuò)增。反應(yīng)參數(shù)：94℃1min，56℃1min，72℃1min，循環(huán)30次，最后72℃延伸10min。引物設(shè)計(jì)如下：TEM型5’－TCGGGGAAATGTGCG－3’（1－15），5’－TGCTTAATCAGTGAGGCACC－3’（953－972）；SHV型5’－GCCTTTATCGGCCTTCACTCAAG－3’（37－59），5’－TTAGCGTTGCCAGTGCTCGATCA－3’（912－934）；CTX－M型CTX－M－1組5’－GGCCCATGGTTAAAAAATCCTGC－3’（60－81，5’加GG），5’－CCGTTTCCGCTATTACAAACCGTTG－3’（926－950）；CTX－M－2組5’－CTCAGAGCATTCGCCGCTCA－3’（13－32），5’－CCGCCGCAGCCAGAATATCC－3’（836－855）；CTX－M－8組5’－ACTTCAGCCACACGGATTCA－3’（237－256），5’－AAGTGGAGCGACAGAGC－3’（1168－1184）；CTX－M－9組5’－GTCACAGCCCTTCGGC－GAT－GATTC－3’（854－876，5’加G），5’－GCGCATGGTGACAAAGAGA－GTGCAA－3’（1－21，5’加GCGC）；OXA型OXA－2組5’－GGAGCAGCAACGATGTTACG－3’（54－73），5’－GGCGGTAACGCTTCAATAGA－3’（896－915）；OXA－10組5’－CCACCAAGAAGGTGCCATGA－3’（106－125），5’－GCGACCTTGAGCGACTTGTT－3’（921－940）。

1.2.3 PCR產(chǎn)物克隆測序：PCR產(chǎn)物純化后與pGEM－T載體連接，轉(zhuǎn)化入大腸埃希氏菌DH5α后，經(jīng)含氨芐西林的麥康凱培養(yǎng)基篩選陽性克隆白斑，堿法抽提質(zhì)粒DNA，EcoRI酶切分析鑒定插入片段，并對質(zhì)粒DNA進(jìn)行序列分析，將所測序列與GeneBank頒布的序列進(jìn)行比對，確定基因型。

2 結(jié)果

2.1 表型確證試驗(yàn) 30株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌和30株產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌在ESBLs確證試驗(yàn)中對頭孢噻肟和頭孢他啶加克拉維酸后抑菌圈直徑與不加克拉維酸的抑菌圈直徑相比增大值≥5mm情況見表1。

表1 60株產(chǎn)ESBLs菌表型確證試驗(yàn)結(jié)果（單位：株）

2.2 基因型分布 60株產(chǎn)ESBLs菌株CTX－M－2組、CTX－M－8組、OXA－2組及OXA－10組PCR擴(kuò)增未發(fā)現(xiàn)陽性標(biāo)本。39株TEM型PCR擴(kuò)增陽性，序列分析證實(shí)均為TEM－1型廣譜酶。CTX－M－1組擴(kuò)增陽性有16株，為13株CTX－M－3、3株CTX－M－15。CTX－M－9組擴(kuò)增陽性有37株，為32株CTXM－14、5株CTX－M－24。SHV型PCR擴(kuò)增陽性有8株：6株為SHV－1、1株為SHV－11、1株為SHV－28，SHV－11與SHV－1相比僅在35位上由谷氨酰胺取代亮氨酸，這些位點(diǎn)的改變不影響酶活性和酶的底物范圍，所以SHV－11和SHV－1不是ESBLs［1］，SHV－28也為廣譜酶［4］。有9株未擴(kuò)增到ESBLs基因型，它們的具體基因型有待進(jìn)一步研究。詳細(xì)的基因型分布見表2。

表2 ESBLs基因型分布

3 討論

不同地區(qū)由于抗生素使用的種類不同，造成ESBLs流行的基因型也不盡相同。歐洲國家主要以TEM型和SHV型為主，我國主要以CTX－M型流行為主［5，6］，這與我國頭孢噻肟的大量使用有著密切的關(guān)系，而歐洲國家頭孢他啶使用得更普遍一些。本次調(diào)查對南京地區(qū)產(chǎn)ESBLs菌TEM型、SHV型、CTX－M型及OXA型基因型進(jìn)行了一次較為全面的檢測，發(fā)現(xiàn)南京地區(qū)ESBLs基因型以CTX－M型為主，主要為CTX－M－3、CTX－M－14，OXA型未擴(kuò)增到陽性，TEM型、SHV型PCR擴(kuò)增陽性產(chǎn)物經(jīng)測序?yàn)門EM－1、SHV－1、SHV－11和SHV－28，它們都屬于廣譜酶。CTX－M型ESBLs對頭孢噻肟水解能力較強(qiáng)，而對頭孢他啶的水解能力很弱。從表型確證試驗(yàn)的結(jié)果也能看出：60株菌中41株菌表現(xiàn)為僅頭孢噻肟組陽性。本次試驗(yàn)有9株菌PCR擴(kuò)增陰性，說明本地區(qū)可能存在上述引物無法擴(kuò)增出的其他ESBLs基因型。

現(xiàn)在世界各地不斷有新的ESBLs基因型報道，隨著抗生素的大量使用還會有更多的基因型出現(xiàn)，因?yàn)椴煌幕蛐退獾牡孜锊煌虼思皶r、準(zhǔn)確的了解本地區(qū)的基因型流行情況，對指導(dǎo)臨床合理使用抗生素有著重要的意義，以達(dá)到控制耐藥菌株的蔓延。

［1］ 俞云松.超廣譜內(nèi)酰胺酶研究概況〔J〕.中國抗生素雜志，2003，28（12）：712－717.

［2］ 俞云松.細(xì)菌β－內(nèi)酰胺酶檢測的臨床意義〔J〕.中華結(jié)核和呼吸雜志，2008，31（6）：475－477.

［3］ National committee for clinical laboratory standards.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing〔S〕.M100－S18.NCCLS，2008.

［4］ 俞云松，陳亞崗，周偉琳，等.一種新基因型SHV－28β－內(nèi)酰胺酶的發(fā)現(xiàn)及其特性的初步研究〔J〕.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2001，24（4）：204－206.

［5］ 孫景勇，倪語星.大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌超廣譜β－內(nèi)酰胺酶的基因分型〔J〕.中國抗感染化療雜志，2002，2（4）：211－214.

［6］ 季淑娟，顧怡明，譚文濤，等.中國部分地區(qū)大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌超廣譜β－內(nèi)酰胺酶基因型研究〔J〕.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2004，27（9）：590－593.