滕麗艷，劉霞，張雪蓮，王洪海

1. 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳研究所遺傳國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200433; 2. 寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，寧夏回族自治區(qū)生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004

結(jié)核病已成為危害人類健康的主要?dú)⑹种?。?jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)報(bào)道，2010年全球共有約2 000萬(wàn)例結(jié)核病患者，約880萬(wàn)新發(fā)病例 (850萬(wàn)～920萬(wàn))，110萬(wàn)例死于結(jié)核病，另有35萬(wàn)例人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染者死于結(jié)核病[1]。近年來(lái)多重耐藥結(jié)核分枝桿菌菌株的出現(xiàn)又為結(jié)核病的防治增加了困難，故研發(fā)抗結(jié)核分枝桿菌的新型藥物迫在眉睫。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)容量為5萬(wàn)個(gè)小分子化合物的化合物庫(kù)進(jìn)行抗結(jié)核分枝桿菌活性初步篩選，獲得數(shù)十個(gè)具有抗結(jié)核分枝桿菌作用的小分子化合物。本研究對(duì)其中一個(gè)小分子化合物E的體外抗結(jié)核分枝桿菌活性綜合評(píng)價(jià)，為其體內(nèi)抗結(jié)核分枝桿菌活性評(píng)價(jià)及未來(lái)可能臨床應(yīng)用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌種結(jié)核分枝桿菌H37Ra菌株為本實(shí)驗(yàn)室保存菌株。

1.1.2試劑Middlebrook 7H9、Middlebrook 7H10培養(yǎng)基為BD公司產(chǎn)品，營(yíng)養(yǎng)添加劑白蛋白-葡萄糖-過(guò)氧化氫酶(albumin dextrose catalase，ADC)為BD公司產(chǎn)品，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、異煙肼(isoniazid，INH)、利福平(rifampicin，RIF)均為Sigma公司產(chǎn)品，化合物E為本實(shí)驗(yàn)室篩選的新型小分子化合物。

1.1.3器材所用器材包括96孔板、Biotek微孔板分光光度計(jì)等。

1.2 方法

1.2.1化合物E對(duì)H37Ra的最低抑菌濃度、最低殺菌濃度的測(cè)定采用96孔板微稀釋法測(cè)定化合物E對(duì)H37Ra的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)，以肉眼未見細(xì)菌生長(zhǎng)的藥物濃度為MIC[2]。取生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的H37Ra，用Middlebrook 7H9-ADC培養(yǎng)基調(diào)至OD600=0.1 (0.5 McFarland，即1×107CFU/ml)，稀釋100倍，將細(xì)菌濃度調(diào)整為約1×105CFU/ml。取滅菌96孔圓底微孔板，每孔加200 μl滅菌去離子水以減少檢測(cè)孔內(nèi)的培養(yǎng)基蒸發(fā)。在第2列孔B～G內(nèi)，加198 μl上述菌液及2 μl初始濃度為0.25 mg/ml的化合物E或RIF或INH。其余孔內(nèi)B3～G11加入100 μl菌液。將第2列孔B～G內(nèi)液體充分混勻后，取100 μl菌液加入到下一個(gè)孔內(nèi)，依此類推。加到G10時(shí)，取出100 μl棄掉。G11為不加化合物E的空白對(duì)照。同一藥物稀釋度設(shè)3組平行對(duì)照。37 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)2周，將肉眼未見細(xì)菌生長(zhǎng)所需最低濃度確定為化合物E的MIC。從肉眼未見細(xì)菌生長(zhǎng)孔取培養(yǎng)物100 μl，涂Middlebrook 7H10-ADC平板，置37 ℃恒溫箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)3～4周，以沒有細(xì)菌生長(zhǎng)所對(duì)應(yīng)孔的濃度為化合物E的最低殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)[3]。各藥物終濃度分別為2.500、1.250、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039、0.019、0.009 μg/ml。

1.2.2化合物E與INH及RIF協(xié)同作用的評(píng)價(jià)采用棋盤滴定法測(cè)定藥物之間是否存在協(xié)同作用[4]，具體方法如下。根據(jù)方法1.2.1測(cè)定出的INH、RIF及化合物E對(duì)H37Ra的MIC結(jié)果，在無(wú)菌96孔板中形成如下矩陣:橫向1～7為INH或RIF，藥物濃度梯度分別為MIC的1/2、1/3、1/4、1/5、1/6/、1/8、1/10;縱向A～F為化合物E，終濃度分別為MIC的1/2、1/3、1/4、1/5、1/6/、1/8、1/10;每孔接種98 μl 1×105CFU/ml菌液及2種藥物各1 μl，即每孔總?cè)萘?00 μl。以不加藥的H37Ra菌液為陰性對(duì)照，置37 ℃培養(yǎng)2周。根據(jù)聯(lián)合使用藥物后每孔的MIC，計(jì)算其分級(jí)抑菌濃度(fractional inhibitory concentration，F(xiàn)IC)及分級(jí)抑菌指數(shù)(fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI)。FIC是聯(lián)合用藥中每種化合物的MIC值，F(xiàn)ICI為聯(lián)合用藥中每種化合物MIC值的總和。FICI<0.5為具有正協(xié)同作用，F(xiàn)ICI>4.0為具有拮抗作用，F(xiàn)ICI值為0.5～4.0認(rèn)為沒有協(xié)同作用，為相加作用[5]。

1.2.3不同環(huán)境條件下化合物E對(duì)不同時(shí)期H37Ra作用效果的評(píng)價(jià)

1.2.3.1正常環(huán)境潛伏感染是結(jié)核分枝桿菌的特點(diǎn)之一，潛伏期結(jié)核分枝桿菌處于非生長(zhǎng)狀態(tài)，篩選對(duì)潛伏期細(xì)菌有效的新型藥物是未來(lái)抗結(jié)核藥物研究的目標(biāo)之一。為評(píng)價(jià)化合物E對(duì)非生長(zhǎng)期結(jié)核分枝桿菌的抑制活性，采用藥物暴露法對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)期結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行活性抑制實(shí)驗(yàn)[6]。分別取生長(zhǎng)10 d、6周的H37Ra菌株，用不含ADC的Middlebrook 7H9培養(yǎng)基調(diào)至OD600=0.1，稀釋10倍，約1×106CFU/ml。藥物稀釋法如1.2.1所述。將添加藥物的96孔板置于37 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)3 d，分別取出各孔對(duì)應(yīng)樣品進(jìn)行梯度稀釋，各取30 μl涂Middlebrook 7H10平板，置37 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)3～4周，以沒有加入化合物E的結(jié)核分枝桿菌(陰性對(duì)照)長(zhǎng)出菌落為準(zhǔn)。每個(gè)樣品稀釋度重復(fù)3次。對(duì)不同稀釋度樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)。根據(jù)菌落計(jì)數(shù)結(jié)果，評(píng)價(jià)化合物E對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)期結(jié)核分枝桿菌的殺菌效果?；衔顴終濃度分別為5.00、2.50、1.25、0.63、0.32、0.16、0.08 μg/ml。

1.2.3.2酸性缺氧環(huán)境H37Ra菌株在沒有ADC的培養(yǎng)基且缺氧環(huán)境中生長(zhǎng)處于停滯狀態(tài)，即持留時(shí)期[6]。制備上述1.2.3.1菌液，同時(shí)配置2瓶不含ADC與甘油的Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基，分別調(diào)節(jié)pH值為5.5、7.5。取無(wú)菌的0.5 ml Eppendorf管，分別加入pH 5.5培養(yǎng)3周的H37Ra菌液、pH 7.0培養(yǎng)3周的H37Ra菌液、pH 5.5培養(yǎng)2個(gè)月的H37Ra菌液、pH 7.0培養(yǎng)2個(gè)月的H37Ra菌液各0.5 ml。INH、RIF和化合物E分別加入相應(yīng)菌液中，調(diào)節(jié)藥物終濃度均為5.00 μg/ml。以不加藥物管作為對(duì)照。37 ℃恒溫箱內(nèi)孵育3 d，分別取出樣品進(jìn)行不同梯度稀釋，取適量涂Middlebrook 7H10平板，置37 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)3～4周，以在這4種培養(yǎng)條件下沒有加入任何化合物的結(jié)核分枝桿菌(陰性對(duì)照)長(zhǎng)出菌落為準(zhǔn)。每個(gè)樣品稀釋度重復(fù)3次。對(duì)不同稀釋度樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)。根據(jù)菌落計(jì)數(shù)結(jié)果，評(píng)價(jià)在酸性缺氧條件下化合物E對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)期結(jié)核分枝桿菌的殺菌效果。

1.2.4結(jié)核分枝桿菌對(duì)化合物E、INH耐藥頻率的確定及耐藥菌株的分離

結(jié)核分枝桿菌尤其是多重耐藥和廣泛耐藥菌株的迅速擴(kuò)散給結(jié)核病控制工作增加了難度。本實(shí)驗(yàn)以臨床治療結(jié)核病的一線藥物INH作為對(duì)照，采用實(shí)驗(yàn)室體外分離耐藥菌株方法，評(píng)價(jià)結(jié)核分枝桿菌對(duì)化合物E是否會(huì)產(chǎn)生耐藥及耐藥頻率等指標(biāo)[7]。取生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的H37Ra，用Middlebrook 7H9-ADC培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)菌濃度為2×108CFU/ml。配制含不同化合物E濃度的Middlebrook 7H10-ADC平板，化合物E濃度分別為4×MIC和8×MIC，同時(shí)以4×MIC和8×MIC的INH作對(duì)照。取上述菌液200 μl點(diǎn)于平板中，澆以含有上述終濃度化合物的Middlebrook 7H10-ADC培養(yǎng)液。同時(shí)，將上述菌液稀釋200倍，取10 μl點(diǎn)于平板內(nèi)，澆以不含任何化合物的Middlebrook 7H10-ADC培養(yǎng)液作為對(duì)照。37 ℃恒溫箱培養(yǎng)3～4周。計(jì)數(shù)含有化合物E的Middlebrook 7H10平板菌落數(shù)，并以不含化合物E的Middlebrook 7H10平板菌落數(shù)作對(duì)照，計(jì)算耐藥頻率。挑耐藥菌落至Middlebrook 7H9-ADC培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)。待耐藥菌生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，根據(jù)方法1.2.1檢測(cè)化合物E對(duì)該耐藥菌株的MIC，觀察MIC是否發(fā)生變化，確定是否耐藥。同時(shí)，將耐藥菌株傳代培養(yǎng)，傳數(shù)代后再次檢測(cè)化合物對(duì)該菌株的MIC，觀察該耐藥菌株是否遺傳穩(wěn)定。重復(fù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 化合物E對(duì)H37Ra的MIC、MBC測(cè)定

微孔法測(cè)定化合物E對(duì)H37Ra的MIC，結(jié)果為0.078 μg/ml，MBC為0.312 μg/ml, MBC/MIC=4。INH和RIF對(duì)H37Ra作用2周的MIC分別為0.039 μg/ml、0.019 μg/ml。

2.2 化合物E與INH及RIF的協(xié)同作用評(píng)價(jià)

化合物E與INH、RIF的體外相互作用結(jié)果如下：化合物E與INH聯(lián)合使用時(shí)，聯(lián)合藥物的MIC分別為應(yīng)用單藥MIC的1/2和1/10，與INH的FICI為0.6。當(dāng)化合物E與RIF聯(lián)合使用時(shí)，聯(lián)合藥物的MIC分別降至應(yīng)用單藥的1/10和1/6，與RIF的FICI為0.27。表明化合物E與INH聯(lián)合用藥有相加作用，與RIF聯(lián)合用藥有協(xié)同作用。

2.3 不同環(huán)境條件下化合物E對(duì)不同時(shí)期H37Ra的作用效果

2.3.1正常環(huán)境盡管化合物E僅作用于結(jié)核分枝桿菌3 d，但對(duì)不同時(shí)期結(jié)核分枝桿菌均表現(xiàn)出明顯的抑制作用，且化合物E、INH、RIF對(duì)對(duì)數(shù)期結(jié)核分枝桿菌有較明顯的抑菌效果(圖1～3)。

Compound E (5.00 μg/ml) showed better antituberculous activity against the 10-day-old H37Ra than the 6-week-old H37Ra.圖1 化合物E對(duì)不同時(shí)期H37Ra作用的效果Fig.1 The antituberculous effects of compound E against H37Ra at different growing stages in 3-day exposure

Isoniazid (5.00 μg/ml) showed better antituberculous activity against 10-day-old H37Ra than the 6-week-old H37Ra as well as compound E.

Compared to compound E and isoniazid, rifampicin (5.00 μg/ml) showed better antituberculous activity against the 6-week-old H37Ra than the 10-day-old H37Ra.

5.00 μg/ml濃度時(shí)，化合物E、INH、RIF對(duì)生長(zhǎng)10 d細(xì)菌的抑制效果為細(xì)菌數(shù)量分別下降(3.22±0.086)lg、(3.27±0.056)lg、(2.69±0.17)lg；而對(duì)生長(zhǎng)6周、代謝處于穩(wěn)定狀態(tài)細(xì)菌的抑制效果為細(xì)菌數(shù)量分別下降(2.57±0.13)lg、(2.48±0.12)lg、(3.23±0.12 lg)。

2.3.2酸性缺氧環(huán)境從圖4中可看出，在pH=7.0時(shí)，5.00 μg/ml化合物E作用于生長(zhǎng)3周和2個(gè)月的結(jié)核分枝桿菌3 d后，與沒有加入化合物E相比，菌落計(jì)數(shù)分別降低2.7 lg、1 lg，顯示出良好的殺菌活性?；衔顴對(duì)生長(zhǎng)2個(gè)月的結(jié)核分枝桿菌的作用雖低于RIF(下降1.7 lg)，但大大強(qiáng)于INH。從圖4中還可看出，對(duì)生長(zhǎng)3周的結(jié)核分枝桿菌，pH 7.0更有利，而對(duì)生長(zhǎng)2個(gè)月的結(jié)核分枝桿菌，pH 5.5條件下化合物E的殺菌效果更明顯。

Compound E (5.00 μg/ml) had activity against both young and old cultures under neutral or acidic conditions. The activities against young culture under neutral condition and old culture under acidic condition were better. Compound E exhibited better activity against old culture than INH but less than RIF (P<0.05).

2.4 結(jié)核分枝桿菌對(duì)化合物E、INH耐藥頻率的測(cè)定及耐藥菌株的分離

經(jīng)3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，與INH相比，H37Ra菌株對(duì)化合物E更不易耐藥，而對(duì)INH的耐藥頻率達(dá)3.4×10-6。INH對(duì)H37Ra耐藥菌株的MIC為200 μg/ml。耐藥菌株傳代培養(yǎng)4代后，INH對(duì)H37Ra耐藥菌株的MIC仍為200 μg/ml，顯示其遺傳穩(wěn)定性。

3 討論

由于近幾年來(lái)耐多藥和廣泛耐藥結(jié)核病的出現(xiàn)和蔓延，以及HIV感染及其他疾病伴結(jié)核分枝桿菌感染患者的增加，使得潛伏結(jié)核病患者數(shù)量明顯增多，全球范圍內(nèi)結(jié)核病形勢(shì)變得更加嚴(yán)峻。開發(fā)新型高效的抗結(jié)核藥物是有效控制結(jié)核病策略的主要部分，特別是篩選具有抗耐藥結(jié)核分枝桿菌及非活躍潛伏結(jié)核分枝桿菌活性的藥物研究至關(guān)重要[8]。

本實(shí)驗(yàn)就是從化合物庫(kù)中篩選具有抗結(jié)核分枝桿菌活性的化合物，為后期深入發(fā)現(xiàn)抗結(jié)核藥物提供先導(dǎo)物。從研究結(jié)果看，本實(shí)驗(yàn)中化合物E具有非常好的抗結(jié)核分枝桿菌活性，MIC達(dá)0.078 μg/ml，MBC/MIC為4，說(shuō)明其具有殺菌作用。通過(guò)3輪篩選，均沒有獲得耐化合物E的結(jié)核分枝桿菌，而INH的耐藥突變率達(dá)到3.4×10-6，說(shuō)明化合物E比INH更不易產(chǎn)生耐藥性。

通常，結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)2周可達(dá)對(duì)數(shù)期，繼續(xù)靜止培養(yǎng)到4周進(jìn)入穩(wěn)定期，6～8周靜止培養(yǎng)的結(jié)核分枝桿菌處于生長(zhǎng)極度緩慢甚至停滯的階段。但現(xiàn)有治療結(jié)核病的藥物多對(duì)生長(zhǎng)期結(jié)核分枝桿菌有效，包括INH。本實(shí)驗(yàn)還測(cè)定了化合物E在不同環(huán)境條件下對(duì)不同生長(zhǎng)期結(jié)核分枝桿菌的抑制活性。如果采用測(cè)定MIC的方法進(jìn)行測(cè)定，停滯生長(zhǎng)的結(jié)核分枝桿菌在轉(zhuǎn)接培養(yǎng)后會(huì)繼續(xù)生長(zhǎng)，因此針對(duì)生長(zhǎng)停滯結(jié)核分枝桿菌的藥物抑制評(píng)價(jià)多采用藥物暴露方法，即將此時(shí)期結(jié)核分枝桿菌短時(shí)間暴露于藥物，通過(guò)細(xì)菌計(jì)數(shù)方式評(píng)價(jià)藥物對(duì)細(xì)菌的抑制作用。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出，在正常條件下，生長(zhǎng)活躍及生長(zhǎng)停滯的結(jié)核分枝桿菌暴露于化合物E后，其生長(zhǎng)均受到非常明顯的抑制殺傷作用，特別是生長(zhǎng)活躍的結(jié)核分枝桿菌被抑制的效果更明顯，活菌數(shù)量顯著降低；在酸性缺氧條件下測(cè)定化合物E的殺菌活性在一定程度上模擬了體內(nèi)環(huán)境，化合物E亦表現(xiàn)出良好的殺菌活性，特別是對(duì)生長(zhǎng)2個(gè)月的結(jié)核分枝桿菌，殺菌作用具有重要意義。在結(jié)核病臨床治療中，為提高藥效及防止細(xì)菌耐藥產(chǎn)生，常采用聯(lián)合用藥。當(dāng)聯(lián)合用藥的2種或3種藥物顯示有協(xié)同或相加作用時(shí)，則證明比單獨(dú)用藥更有效[9,10]。從本實(shí)驗(yàn)中化合物E與INH和RIF的聯(lián)合用藥結(jié)果來(lái)看，化合物E沒有表現(xiàn)出與一線藥物有明顯的拮抗作用?；衔顴與INH、RIF聯(lián)用后，MIC均下降，分別表現(xiàn)為相加和協(xié)同作用。在對(duì)化合物E的后續(xù)研究中，可繼續(xù)檢測(cè)其在體外與其他一線抗結(jié)核藥物如乙胺丁醇聯(lián)用的效果。

在化合物E抗結(jié)核分枝桿菌活性評(píng)價(jià)方面，本文只進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)，很多研究如其抗耐藥結(jié)核分枝桿菌的活性、體內(nèi)抗結(jié)核分枝桿菌的活性等還需進(jìn)一步研究。但化合物E體外良好的抗結(jié)核分枝桿菌活性及對(duì)生長(zhǎng)停滯結(jié)核分枝桿菌的抑制活性提示，其可作為未來(lái)抗結(jié)核藥物候選物的先導(dǎo)化合物，值得進(jìn)一步深入評(píng)價(jià)。

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