劉青松 朱興春 張均 袁國華 羅雄燕 楊明輝 唐中

(1.川北醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗系; 2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科; 3.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫研究所 四川南充 637000)

食管癌是全世界常見的惡性腫瘤之一。染色體基因不穩(wěn)定是人類腫瘤發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié),而端粒通過保護染色體的完整性而維持基因組的穩(wěn)定性。端粒異?？杉せ蠲氀軘U張性共濟失調(diào)癥突變蛋白(ATM)和共濟失調(diào)毛細血管擴張癥Rad3相關(guān)蛋白激酶(ATR)依賴的DNA損傷反應(yīng)途徑導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂(DSBs),并促進失去功能的端粒非同源末端融合(NHEJ)[1]。由MRE11、Rad50和Nijmegen斷裂綜合癥蛋白(Nbsl)組成的MRN復(fù)合物對DSBs和NHEJ具有保護作用[2]。MRE11具有DNA結(jié)合、雙鏈DNA3’-5’外切酶和單鏈DNA結(jié)構(gòu)特異性內(nèi)切酶活性等功能,這些功能對于DNA末端封閉而防止DNA末端結(jié)構(gòu)融解是必需的。因此研究Mre11對于食管癌的發(fā)生機制的深入理解具有重要意義。為此,本文旨在通過實時熒光定量PCR方法檢測Mre11 mRNA在食管癌組織中的表達。

表1 定量PCR的基因引物序列

圖1 MRE11 PCR產(chǎn)物電泳圖

圖2 MRE11 PCR產(chǎn)物溶解曲線圖

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 對象 收集2009年5月至2010年12月在川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院手術(shù)的食管癌中心組織和癌旁組織22例。所有患者均為漢族人,其中男性21例,女性1例,年齡42～74歲,平均年齡62歲。所有病例通過病理組織細胞形態(tài)學(xué)加以確診。所有標(biāo)本儲存在用DEPC水處理的EP管中,-80℃低溫保存?zhèn)溆?。同時詳細記錄食管癌相關(guān)記錄,如性別、年齡、病理分型、臨床分期、腫瘤大小等相關(guān)信息。其中臨床分期標(biāo)準(zhǔn)為:T1腫瘤侵犯粘膜或粘膜下層,T2腫瘤侵犯肌層,T3腫瘤侵犯外膜,T4腫瘤侵犯鄰近結(jié)構(gòu)。

1.1.2 器材與試劑 本研究涉及主要器材與試劑包括:Trizol(天根);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(成都博瑞克);PCR試劑(天根,2×Taq PCR Master Mix);定量PCR試劑(ABGAB); PCR儀(BIO-RAD Mycycler);定量PCR儀(ABI 7900HT);凝膠成像儀(BIO-RAD);紫外分光光度計(島津,UV-2550)。

表2 MRE11基因在食管鱗癌組織中的表達(±s)

表2 MRE11基因在食管鱗癌組織中的表達(±s)

組別 例數(shù) MRE11 t P癌中心組織22 0.14±0.12 2.90 0.006癌旁組織 21 0.29±0.22

1.2 方法

1.2.1 RNA抽提和逆轉(zhuǎn)錄 (1)總RNA抽提與cDNA鏈合成:剪取約100mg組織放入陶瓷碾缽中,加液氮進行碾磨成粉末,然后加Trizol試劑1mL,繼續(xù)碾磨。將碾磨液轉(zhuǎn)入1.5mL的Ep管,提取總RNA,取2μL總RNA溶于48μL經(jīng)DEPC處理的水中,用紫外分光光度計測定其A260/A280值,檢測其純度和濃度。按每20μL體積加2μg RNA比例,依照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作合成cDNA。(2)實時定量PCR:MRE11和內(nèi)參APL13A引物由上海Sangon公司合成,序列見表1。PCR反應(yīng)體系總體積為20μL,各反應(yīng)參數(shù)如下:2.5 Master mix 9μL;上下游引物(10μmol/L)各0.25μL,cDNA 1μL。反應(yīng)條件:經(jīng)50℃ 2min熱啟動和95℃5min變性后,反應(yīng)體系再經(jīng)40個循環(huán)的95℃ 15sec,60℃ 1min反應(yīng),并在此循環(huán)過程中收集熒光信號。同時設(shè)立無模板對照監(jiān)控反應(yīng)進程。在實驗結(jié)束后進行溶解曲線分析,以鑒定產(chǎn)物是否單一,確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。(3)統(tǒng)計方法:數(shù)據(jù)采用SPSS10.0 for windows做Explore正態(tài)性分析,MRE11的表達呈正態(tài)分布,因此其表達量用(±s)表示,并進行獨立樣本t檢驗,以P<0.05為顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 MRE11基因PCR產(chǎn)物分析

在進行定量PCR前,我們采用普通逆轉(zhuǎn)錄PCR對MRE11基因進行了分析,以鑒定MRE11基因引物的是否可擴增出特異性MRE11基因。電泳結(jié)果顯示,該引物不僅能得到單一的PCR條帶,而且引物二聚體含量極低(圖1)。說明該引物可用于基于SBRY-Green熒光染料的實時熒光定量PCR分析。

在定量PCR反應(yīng)結(jié)束后,我們立即對產(chǎn)物進行解離曲線分析。發(fā)現(xiàn)在MRE11基因PCR產(chǎn)物理論TM值(84℃)出有單一峰值出現(xiàn)(實測值為81.5℃),且在其他溫度下無峰出現(xiàn)(圖2)。說明我們得到的數(shù)據(jù)為MRE11基因的真實反應(yīng),可用于下一步分析。

2.2 MRE11在食管鱗癌組織中的表達

我們檢測了22例食管鱗癌組織及其相應(yīng)癌旁組織MRE11基因的表達。其中22例癌組織中均得到相應(yīng)信號,但癌旁組織有1例沒有檢測到熒光信號。因此我們對22例癌組織標(biāo)本和21例癌旁組織標(biāo)本MRE11基因的表達進行了分析。與癌旁組織相比,癌組織中的MRE11基因表達顯著降低,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.006)(表2)。

2.3 MRE11 mRNA表達與食管鱗癌臨床病理關(guān)系

為了明確MRE11的表達在食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展中的意義,我們對其表達與食管鱗癌的臨床病理進行了進一步分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),MRE11 mRNA的表達與年齡、分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及有無吸煙、飲酒史均無關(guān),但與臨床分期和腫瘤生長速度有關(guān)。數(shù)據(jù)顯示,T1和T2期患者的MRE11 mRNA的表達顯著低于T3和T4期患者(P=0.000),腫瘤生長較慢的患者MRE11 mRNA的表達也低于生長較快的患者(P=0.012)。

3 討論

有研究發(fā)現(xiàn),食管鱗癌存在很高的染色體畸變率[3]。染色體畸變引起的染色體基因組不穩(wěn)定是人類腫瘤發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié),維持適當(dāng)?shù)亩肆Ｊ侨蚪M穩(wěn)定的關(guān)鍵。哺乳動物端粒由TTAGGG重復(fù)片段組成,并與端粒保護蛋白復(fù)合體(shelterin)結(jié)合。端粒的磨損或shelterin脫帽可引起DNA損傷反應(yīng)和無功能端粒末端融合[4],從而導(dǎo)致基因組DNA的不穩(wěn)定性。DNA損傷反應(yīng)是一個包含信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞周期調(diào)節(jié)和DNA修復(fù)的功能網(wǎng)絡(luò)。由MRE11組成的MRN復(fù)合物是DNA損傷反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)復(fù)合物。研究表明,MRN復(fù)合物在維持端粒、細胞周期檢查點信號系統(tǒng)、DNA復(fù)制和DSBs過程都是必需的[5]。

MRN復(fù)合物作為DNA DSBs的感應(yīng)元件,位于斷裂位點并重征ATM[5]。MRE11是MRN復(fù)合物的重要成員之一,具有DNA結(jié)合、雙鏈DNA3’-5’外切酶和單鏈DNA結(jié)構(gòu)特異性內(nèi)切酶活性等功能。Deng[1]等研究表明,MRN復(fù)合物是細胞傳感端粒酶異常的物質(zhì),MRE11核酸酶的活性可能導(dǎo)致端粒3’端失去融合染色體的能力。當(dāng)MRN復(fù)合物感應(yīng)有端粒磨損,端粒保護功能喪失時,MRE11核酸酶活性在3’端端粒懸凸消除,從而促進端粒融合,導(dǎo)致染色體基因組不穩(wěn)定性。此外,MRE11還能保護端粒重復(fù)片段。結(jié)果表明,MRE11 mRNA在食管鱗癌組織中的表達相比癌旁組織顯著降低?？梢?MRE11降低可能是食管鱗癌發(fā)生的重要內(nèi)因。

進一步分析MRE11 mRNA和食管鱗癌臨床病理特征關(guān)系時發(fā)現(xiàn),MRE11 mRNA在食管鱗癌組織中的表達與年齡、分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及有無吸煙、飲酒史均無關(guān),但與臨床分期和腫瘤生長速度有關(guān)。結(jié)果表明,在臨床分期較低患者(T1和T2期)MRE11 mRNA的表達顯著低于臨床分期較高(T3和T4期)患者,腫瘤生長較慢的患者MRE11 mRNA的表達也低于生長較快的患者。這可能是因為MRE11表達的降低影響MRN復(fù)合物形成,導(dǎo)致細胞周期檢查點信號系統(tǒng)紊亂,從而影響腫瘤細胞的生長速度?？傊?我們的實驗結(jié)果表明,不管在食管鱗癌的發(fā)生,還是在食管鱗癌的生長發(fā)展過程,MRE11均具有重要作用。

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[3] 康維,姚漢清,房麗麗.食管鱗癌3、8、10、20和Y染色體的非整倍性分析[J].遺傳,2009,31(3):255～260.

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