孫丹丹 李 昌 李太元 朱 娜 杜壽文 任大勇 劉存霞 秦艷青 李 沂 金寧一

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，長春130122)

艾滋病(Acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)是由人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)引起的一種慢病毒病。該病最早發(fā)現(xiàn)于1981年，HIV-1為其主要病原［1］。我國1985年出現(xiàn)首例AIDS患者，目前感染人數(shù)亦接近100萬，感染人數(shù)已居全球第14位、亞洲第2位，并且仍以30%的速度持續(xù)遞增。由于HIV的復(fù)雜與高度變異性，加之病毒感染與致病機(jī)制、免疫與保護(hù)性之間的關(guān)系尚不明晰，以及缺少合適的細(xì)胞與動物評價模型，構(gòu)成了對該病預(yù)防與治療的重要阻礙。本課題組曾利用真核表達(dá)載體系統(tǒng)pDisplay和反轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)pFB-neo，構(gòu)建了能夠穩(wěn)定表達(dá)HIV-1外膜蛋白Gp120和核心蛋白Gag的細(xì)胞模型，取得了初步試驗結(jié)果［2，3］，但真核表達(dá)系統(tǒng) pDisplay不能將基因有效地整合到宿主細(xì)胞內(nèi)，所以此模型只能用于體外效果評價研究，對于體內(nèi)的作用效果與機(jī)制卻無能為力;而反轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)pFB-neo雖然能整合到宿主細(xì)胞內(nèi)，但不能感染非分裂期細(xì)胞，具有一定局限性，并且隨機(jī)整合的效率并不高，限制了其應(yīng)用。

因此，本研究在前期工作基礎(chǔ)上，擬以慢病毒作為載體進(jìn)行細(xì)胞模型的構(gòu)建研究。而構(gòu)建穿梭質(zhì)粒并驗證其能否表達(dá)是慢病毒包裝的前提和重要環(huán)節(jié)。本研究成功構(gòu)建并表達(dá)了慢病毒介導(dǎo)的HIV-1 ENV蛋白，為下一步慢病毒的包裝以及細(xì)胞模型、動物模型的建立奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株及細(xì)胞株 質(zhì)粒pLVX-IRES-Zs-Green1、大腸桿菌 Stb13購自 Invitrogen公司：質(zhì)粒pVAXI-env、HEK293T細(xì)胞由本室保存。

1.2 主要試劑 高糖DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清購自HyClone公司;TRIzol購自 Invitrogen公司;opti-MEM培養(yǎng)液購自Gibco公司;FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑購自Roche公司?？筭p120/160兔多克隆抗體購自北京博菲康生物技術(shù)有限公司;辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG、FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司;質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖匈徸訠ioTeke公司;膠回收試劑盒購自Axygen公司;Taq DNA聚合酶，T4 DNA連接酶以及限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司。

1.3 env基因的點突變 根據(jù)GenBank中的env基因序列，將1 601 bp處的TAG突變?yōu)镃AG，去除終止密碼子，突變基因由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.4 重組質(zhì)粒pLV-env的構(gòu)建 利用EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切突變后的重組質(zhì)粒pVAXⅠ-env及慢病毒載體pLVX-IRES-ZsGreen1，切膠回收2 571 bp的env片段及8 204 bp線性化的pLVX-IRES-Zs-Green1慢病毒載體。T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化Stb13感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氨芐青霉素(100 mg/ml)抗性篩選獲得陽性克隆進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)與鑒定。

1.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞 于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)制備HEK-293T單層細(xì)胞(5×105個細(xì)胞/孔)，置37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24小時;轉(zhuǎn)染前2小時吸棄培養(yǎng)液，加入opti-MEM(1 ml/孔)。取3 μg含有外源基因的重組質(zhì)粒pLV-env，加入100 μl無血清、無抗生素的opti-MEM培養(yǎng)液中，充分混勻，加入8 μl FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑，混勻并于室溫作用1小時。將上述轉(zhuǎn)染懸液緩慢加入相應(yīng)轉(zhuǎn)染孔中，并于37℃、5%CO2條件下作用8小時，吸棄轉(zhuǎn)染懸液，補加含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液(2 ml/孔)，于37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)72小時。熒光顯微鏡下觀察熒光蛋白表達(dá)情況，同時以pLVX-IRES-ZsGreen1作為對照。

1.6 HEK293T細(xì)胞表達(dá)HIV-1包膜蛋白的檢測

1.6.1 RT-PCR檢測 收集各組細(xì)胞，采用Trizol法提取細(xì)胞總 RNA，反轉(zhuǎn)錄生成 cDNA，進(jìn)行 RTPCR，env基因引物序列：上游 EnvF：gggAATTCGCCACCATGAGAGTGAAGGAG;下游 EnvR：ggCTCgAg TTATAGCAAAATCCTTTCCAAGCCCTG。PCR反應(yīng)體系及條件：20 μmol/L上游引物EnvF和下游引物EnvR 各 1 μl;10 mmol/L dNTP Mixture 1 μl;Ex Taq DNA 聚合酶 0.5 μl;10 × PCR Buffer 2.5 μl;cDNA 2 μl;去離子水 17 μl;總體系 25 μl。94℃ 預(yù)變性 5分鐘，94℃變性40秒、56℃退火30秒、72℃延伸1分鐘，循環(huán)30次，72℃后延伸10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后取反應(yīng)產(chǎn)物5 μl進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.6.2 免疫印記檢測 收集各組細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞裂解液裂解提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離蛋白后，將其電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，并以空載體pLVX-IRES-ZsGreen1轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組作為對照。將硝酸纖維素膜取下后用封閉液(5%脫脂乳)室溫封閉2小時;TBST洗滌3次，每次10分鐘;再放入封閉液稀釋的抗gp120/160兔多克隆抗體(1∶2 000)中孵育，4℃過夜;TBST洗滌 3次，每次10分鐘，與辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶10 000)室溫作用2小時;TBST洗滌3次，每次10分鐘，ECL-plus曝光觀察結(jié)果。

1.7 ENV蛋白的定位檢測 由于穿梭表達(dá)載體pLVX-IRES-ZsGreen1中含有熒光，進(jìn)行檢測時會出現(xiàn)非特異性，所以我們以pVAXI-env進(jìn)行了env基因定位的檢測。將玻片放入6孔板內(nèi)，轉(zhuǎn)染72小時，取出玻片，用PBST沖洗3次;冷甲醇固定30分鐘;5%BSA 37℃封閉2小時，PBST洗滌3次，每次5分鐘;封閉緩沖液稀釋的抗 gp120/gp160兔多克隆抗體(1∶2 000)，37℃作用2小時，PBST洗滌3次，每次5分鐘;再加入FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶2 000)繼續(xù)作用2小時，PBST洗滌3次，每次5分鐘;激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pLV-env的構(gòu)建與鑒定 重組質(zhì)粒pLV-env的構(gòu)建過程如圖1所示。EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，在8 200 bp處和2 600 bp處出現(xiàn)兩條條帶，與預(yù)期結(jié)果相一致(圖2)，證明構(gòu)建成功。

圖1 重組質(zhì)粒pLV-env的構(gòu)建流程圖Fig．1 Construction of recombinant plasmid pLV-env

圖2 重組質(zhì)粒pLV-env的酶切鑒定結(jié)果Fig．2 Results of restriction enzyme digestion of recombinant plasmid pLV-env

圖3 熒光顯微鏡下觀察結(jié)果(×100)Fig．3 Fluorescence microscope observations( ×100)

2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞 重組質(zhì)粒pLV-env、空載體 pLVX-IRES-ZsGreen1分別轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，72小時后熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組均出現(xiàn)亮綠色熒光(圖3)，未轉(zhuǎn)染組則沒有。由于熒光蛋白基因位于目的基因下游，初步表明外源基因得到表達(dá)。

2.3 RT-PCR檢測 采用Trizol法提取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，進(jìn)行RT-PCR，可擴(kuò)增出2 600 bp左右的目的條帶，表明目的基因成功轉(zhuǎn)錄(圖4)。

2.4 ENV蛋白免疫印記檢測 裂解細(xì)胞后提取蛋白進(jìn)行蛋白免疫印跡檢測，重組質(zhì)粒pLV-env轉(zhuǎn)染組在分子質(zhì)量為120 kD處出現(xiàn)特異條帶，而空載體對照及未轉(zhuǎn)染對照組未出現(xiàn)特異條帶，表明轉(zhuǎn)染后的重組質(zhì)粒pLV-env成功表達(dá)了HIV-1 ENV蛋白，且具有抗原性(圖5)。

圖4 env基因RT-PCR檢測結(jié)果Fig．4 RT-PCR results of env gene

圖5 ENV蛋白Western blot檢測結(jié)果Fig．5 ENV protein in Western blot analysis

圖6 ENV蛋白激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果Fig．6 ENV protein result of laser confocal microscope

2.5 ENV蛋白的定位檢測 將pVAXⅠ-env轉(zhuǎn)染72小時的HEK293T細(xì)胞，進(jìn)行間接免疫熒光染色，共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光分布，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜表面有ENV表達(dá)(綠色熒光信號)，表明env基因表達(dá)后可以分泌到膜上(圖6)。

3 討論

HIV-1env基因在人免疫缺陷病毒的生命周期中發(fā)揮重要作用，即病毒吸附及靶細(xì)胞融合。env基因編碼約863個氨基酸的前體蛋白并糖基化成gp160，糖基化后相對分子質(zhì)量應(yīng)是16 000，剪切后相對分子質(zhì)量為12 000的gp120和41 000的gp41［4，5］，gp120 含有中和抗原決定簇，在病毒與細(xì)胞融合中起重要作用。gp120與跨膜蛋白gp41以非共價鍵相連，常常以多聚體(多以三聚體)形式存在［6］。gp41與靶細(xì)胞融合，促使病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，gp41亦有較強抗原性，能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體反應(yīng)。除此之外，在自然感染過程中HIV-1的ENV蛋白是引起中和抗體的主要靶抗原，寡聚體形式存在的ENV含有和空間結(jié)構(gòu)相關(guān)的抗原決定簇，是制備疫苗的良好免疫原。gp160可以和HIV感染初期產(chǎn)生的抗體反應(yīng)［7，8］，將 gp160抗體用于 HIV抗原檢測，可以使窗口期由2～3個月縮短到2周左右［9，10］。ENV蛋白還富含CTL表位，通過MHC-I類分子限制性抗原提呈途徑誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生CD8+CTL，ENV蛋白在保護(hù)機(jī)體免受強毒感染的過程中發(fā)揮著重要作用［11］。目前已有ENV蛋白在大腸桿菌及釀酒酵母中成功表達(dá)的報道［12，13］，而 ENV 蛋白在真核細(xì)胞中表達(dá)的報道卻甚少，所以本研究以人胚腎細(xì)胞HEK293T為靶細(xì)胞，驗證ENV蛋白的表達(dá)。

慢病毒(Lentivirus)作為逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retrovirus)的一個亞科，其不僅是引起人類或動物疾病的重要病原體，具有重要的社會公共衛(wèi)生意義。同時，該病毒也可作為基因轉(zhuǎn)移載體，在基因治療以及外源基因的導(dǎo)入方面發(fā)揮著重要作用。逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體最重要的一個特點是它可以有效地整合入靶細(xì)胞基因組并穩(wěn)定持久地表達(dá)所帶的外源基因，病毒基因組以轉(zhuǎn)座的方式整合，其基因組不會發(fā)生重排，因此所攜帶的外源基因也不會改變，但逆轉(zhuǎn)錄病毒載體也存在不能感染非分裂期細(xì)胞、隨機(jī)整合效率不高等不足，限制了其進(jìn)一步應(yīng)用。而慢病毒載體(Lentiviral vectors，LV)與簡單的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體相比，除具有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的優(yōu)點外，其可感染分裂細(xì)胞及非分裂細(xì)胞，而且還具有轉(zhuǎn)移基因片段容量較大、目的基因表達(dá)時間長、不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)等優(yōu)點，已成為當(dāng)前基因轉(zhuǎn)移載體研究的熱點［15，16］。病毒載體經(jīng)改造后，不在宿主細(xì)胞繁殖，不會導(dǎo)致寄主細(xì)胞的死亡，被它感染的或轉(zhuǎn)化的動物細(xì)胞能夠連續(xù)傳代。因此本研究以慢病毒載體構(gòu)建表達(dá)系統(tǒng)，為后續(xù)慢病毒的包裝及細(xì)胞模型的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

前期工作中，對HIV-1包膜蛋白ENV進(jìn)行了克隆，但測序結(jié)果顯示，該序列在1 601 bp處存在終止密碼子，會導(dǎo)致翻譯提前終止而不能夠得到完整蛋白。從而，本研究利用點突變技術(shù)突變了此終止密碼子。通過RT-PCR、Western blot檢測，經(jīng)點突變后的env基因在慢病毒載體介導(dǎo)下，轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞HEK293T后能夠得到良好表達(dá)，并且在激光共聚焦顯微鏡下可觀察到表達(dá)后的ENV蛋白分泌到細(xì)胞膜上。以上結(jié)果表明成功構(gòu)建了重組慢病毒質(zhì)粒，點突變后env基因能夠得到良好表達(dá)且具有抗原活性，而且env基因表達(dá)后能夠模仿HIV-1天然感染過程，分泌到細(xì)胞膜上，從而為下一步慢病毒的包裝以及細(xì)胞模型和動物模型的構(gòu)建奠定了堅實基礎(chǔ)。

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