蔣建國(guó) 劉瑞玲 付永鋒 程訓(xùn)佳 (復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，上海200032)

花粉癥是一種嚴(yán)重影響人類健康的過(guò)敏反應(yīng)性疾病。在日本，日本柳杉(Cryptomeria japonica)花粉是春季空氣中的主要變應(yīng)原，吸入飄散在空氣中的花粉會(huì)引起花粉特異性的IgE產(chǎn)生，導(dǎo)致過(guò)敏性鼻炎、過(guò)敏性哮喘等過(guò)敏反應(yīng)性疾?。?］，而日本柳杉在我國(guó)不同地區(qū)的園林中也有大量栽培。

日本柳杉花粉中含有多種變應(yīng)原蛋白，目前有兩種變應(yīng)原研究的比較詳細(xì)透徹，已被國(guó)際免疫學(xué)會(huì)變應(yīng)原命名分會(huì)官方認(rèn)定為主要的變應(yīng)原，一種是具有果膠酶活性的Cry j 1，一種是具有聚甲基半乳糖醛酶活性的Cry j 2［2］。CJP-6是在日本柳杉花粉中被發(fā)現(xiàn)的第3種主要變應(yīng)原，屬于異黃酮還原酶家族，由306個(gè)氨基酸組成，具有很高的IgE結(jié)合活性和免疫原性［3］。目前，國(guó)內(nèi)臨床主要使用花粉浸提液對(duì)花粉癥患者進(jìn)行診斷和脫敏治療，但浸提液的組分非常復(fù)雜，容易引起診斷的假陽(yáng)性和過(guò)敏反應(yīng)，且難以標(biāo)準(zhǔn)化［4］。利用基因工程技術(shù)制備日本柳杉花粉變應(yīng)原CJP-6，有助于診斷與治療試劑的標(biāo)準(zhǔn)化，促進(jìn)日本柳杉花粉過(guò)敏反應(yīng)性疾病的診斷與治療研究。

本研究通過(guò)RT-PCR獲得上海地區(qū)日本柳杉花粉的cDNA，從中克隆和表達(dá)了cjp-6基因，并通過(guò)Dot blot和ELISA方法檢測(cè)其與過(guò)敏病人血清中IgE的反應(yīng)性，為過(guò)敏性疾病的臨床診斷和治療奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 植物材料 本實(shí)驗(yàn)所采用的植物材料是上海地區(qū)日本柳杉花粉，采摘后于－80℃保存。

1．1．2 菌株和載體 原核表達(dá)載體pET-19b購(gòu)自美國(guó)Novagen公司，大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自大連 TaKaRa公司，E．coli BL21 Star(DE3)pLysS購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1．1．3 主要實(shí)驗(yàn)材料 Rneasy Total RNA Kit購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司，GeneAmp RNA PCR Kit購(gòu)自美國(guó)Perkin-Elmer公司，His結(jié)合樹(shù)脂購(gòu)自 Novagen公司，Taq 酶、100 bp ladder Markers、λHind Ⅲ DNA Markers、DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶 XhoⅠ和BamHⅠ等購(gòu)自大連TaKaRa公司。引物合成和測(cè)序由上海Invitrogen公司完成。本研究所用60份日本柳杉花粉過(guò)敏病人的血清由日本東京大學(xué)附屬病院提供，血清由UniCAP檢測(cè)證實(shí)了其反應(yīng)性，而且UniCAP檢測(cè)值在三級(jí)以上;60份塵螨過(guò)敏患者的血清和60份蒿草過(guò)敏患者的血清由天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院的變態(tài)反應(yīng)科提供，UniCAP檢測(cè)值在三級(jí)以上。

1．2 方法

1．2．1 總 RNA的提取和 cDNA的獲取 按照Rneasy Total RNA試劑盒的使用說(shuō)明，提取日本柳杉的總RNA，使用GeneAmp RNA PCR Kit進(jìn)行RTPCR，獲得 cDNA。

1．2．2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GeneBank公布的CJP-6變應(yīng)原(AY028631)mRNA序列設(shè)計(jì)引物，并加入XhoⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基。正向引物為5'-CCCTCGAGATGGGAGGAAGTAGGGTT-3'，反向引物為5'-CCGGATCCTCATACAAATGCACTG-3'。

1．2．3 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增編碼cjp-6的基因片段;將純化的PCR產(chǎn)物以XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切后，插入pET-19b表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109，將菌液涂布于LB瓊脂板(含氨芐青霉素 50 μg/ml，氯霉素 34 μg/ml)，37℃過(guò)夜培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定和測(cè)序鑒定。

1．2．4 重組日本柳杉變應(yīng)原CJP-6的表達(dá) 重組質(zhì)粒pET19b-CJP6轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 Star(DE3)pLysS后，涂布于LB瓊脂板，37℃溫箱中培養(yǎng)過(guò)夜。挑選單一菌落入1 600 ml LB培養(yǎng)液(含氨芐青霉素50 μg/ml，氯霉素 34 μg/ml)中，37℃ 220 r/min 振搖，培養(yǎng)至 OD600約為0．5時(shí)，加入1 mmol/L的IPTG，37℃誘導(dǎo)3小時(shí)，4℃ 8 000 r/min離心10分鐘，棄上清，收集細(xì)菌沉淀。將沉淀超聲后取其少量，12．5%SDS-PAGE 電泳，觀察結(jié)果。

1．2．5 重組日本柳杉變應(yīng)原CJP-6的純化 參照Novagen公司的His Binding kit使用說(shuō)明，用His結(jié)合樹(shù)脂純化蛋白，純化蛋白以12．5%的SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白純度，DC Protein Assay試劑盒檢測(cè)重組蛋白含量，4℃冰箱保存。

1．2．6 Dot blot檢測(cè) 參照 Tachibana 等［5］的方法進(jìn)行Dot blot檢測(cè)。將重組日本柳杉變應(yīng)原CJP-6蛋白加樣于硝酸纖維素膜上，室溫干燥后，以含3%牛血清白蛋白的PBS濕盒內(nèi)室溫封閉1小時(shí);加入日本柳杉過(guò)敏病人血清(1∶5稀釋)，4℃孵育過(guò)夜;加入HRP goat Anti-Human IgE 抗體(1∶250稀釋)，室溫孵育1小時(shí);以DAB顯色，20分鐘后終止反應(yīng)。

1．2．7 ELISA檢測(cè) 參照已有文獻(xiàn)［6］稍作修改進(jìn)行，重組變應(yīng)原以0．05 mol/L、pH9．6的碳酸鹽緩沖液稀釋至 1 μg/ml，每孔用 0．1 ml包被酶標(biāo)板，4℃過(guò)夜;日本柳杉、塵螨與蒿草過(guò)敏患者血清和正常人血清(1∶5稀釋)4℃孵育過(guò)夜;HRP goat Anti-human IgE抗體室溫孵育1小時(shí);最終用OPD顯色，反應(yīng)30分鐘終止反應(yīng)。

2 結(jié)果

2．1 cjp-6基因的擴(kuò)增 用RNA提取試劑盒提取日本柳杉花粉的總RNA，使用GeneAmp RNA PCR Kit進(jìn)行RT-PCR，獲得cDNA。以cDNA為模板，用引物通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增出CJP-6蛋白編碼基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示在900 bp左右處有明顯條帶，大小與理論值(921 bp)相符(圖1)。

圖1 cjp-6基因PCR產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳分析Fig．1 2%argarose gel electrophoresis analysis of PCR production of cjp-6 gene

圖2 cjp-6核苷酸序列同源性比較Fig．2 Comparison of nucleotide sequence between cjp-6 with AY028631

圖3 重組變應(yīng)原CJP-6的SDS-PAGE分析圖Fig．3 SDS-PAGE analysis of the recombinant CJP-6 protein

2．2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建與序列分析 表達(dá)載體pET19b-CJP-6經(jīng)XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切，電泳結(jié)果表明目標(biāo)條帶與cjp-6基因片段的PCR產(chǎn)物大小一致，說(shuō)明成功構(gòu)建了日本柳杉花粉變應(yīng)原CJP-6的重組質(zhì)粒pET19b-CJP-6。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定，采用 Vector NTI 10軟件和 GENETYX-MAC Ver13軟件系統(tǒng)推定氨基酸序列，并與GenBank中公布的序列(AY028631)進(jìn)行比對(duì)。CJP-6僅有1個(gè)核苷酸位點(diǎn)與AY028631不同(圖2)，而無(wú)氨基酸殘基的改變。

圖4 重組變應(yīng)原CJP-6的Dot blot鑒定Fig．4 Dot blot analysis of CJP-6 protein

2．3 重組蛋白CJP-6的表達(dá)與純化 以重組質(zhì)粒pET19b-CJP-6轉(zhuǎn)化E．coli BL21 Star(DE3)pLysS，挑取轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)3小時(shí)，菌體經(jīng)超聲破碎后，進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示在Mr約為36 kD處有明顯蛋白表達(dá)條帶(圖4)，與預(yù)測(cè)分子量36．7 kD相符。重組蛋白主要以可溶性形式表達(dá)，經(jīng)His結(jié)合樹(shù)脂純化后純度可達(dá)到95%以上(圖3)。使用DC Protein Assay試劑盒檢測(cè)重組蛋白含量，最終結(jié)果表明每升培養(yǎng)液的細(xì)菌可制備50 mg日本柳杉CJP-6變應(yīng)原重組蛋白。

2．4 Dot blot檢測(cè) 重組CJP-6可與日本柳杉花粉過(guò)敏病人血清中的IgE發(fā)生特異性結(jié)合，而與正常人血清中的IgE不反應(yīng)(圖4)。

2．5 ELISA檢測(cè) 重組CJP-6與日本柳杉花粉過(guò)敏患者血液中的IgE有良好的結(jié)合活性，具有免疫原性和免疫反應(yīng)性，其中有32個(gè)患者血清與重組CJP-6反應(yīng)呈陽(yáng)性，陽(yáng)性率為53．3%(圖5)。為了解CJP-6與中國(guó)過(guò)敏性疾病患者，尤其是塵螨和蒿草過(guò)敏患者的血清反應(yīng)性，進(jìn)行ELISA檢測(cè)其與IgE的反應(yīng)性，重組變應(yīng)原CJP-6與塵螨過(guò)敏患者血清反應(yīng)陽(yáng)性率為45%，與蒿草花粉過(guò)敏患者血清反應(yīng)陽(yáng)性率為51．6%，其反應(yīng)性的平均值與日本柳杉花粉過(guò)敏的患者血清相似(圖6)。

3 討論

花粉過(guò)敏性疾病是一種嚴(yán)重危害人類健康的常見(jiàn)病，由日本柳杉花粉引起的過(guò)敏性哮喘是日本最嚴(yán)重的過(guò)敏性疾病，在春季日本柳杉花粉會(huì)誘發(fā)20%以上的日本人出現(xiàn)過(guò)敏性哮喘［2，7］。日本柳杉作為重要的綠化樹(shù)種，在中國(guó)很多地區(qū)都有種植，日本柳杉花粉過(guò)敏原有可能成為中國(guó)過(guò)敏性疾病潛在的過(guò)敏原，應(yīng)引起我們重視。而目前，尚未有對(duì)日本柳杉花粉過(guò)敏性疾病的標(biāo)準(zhǔn)化診斷與脫敏治療試劑，國(guó)內(nèi)臨床上主要使用花粉浸提液對(duì)花粉癥患者進(jìn)行診斷和脫敏治療，但花粉浸提液成分很多，影響診斷與治療的準(zhǔn)確性與療效。利用DNA重組技術(shù)制備花粉中的主要變應(yīng)原，具有成分單一、操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，將為過(guò)敏反應(yīng)性疾病的診斷與治療起重要作用。

日本柳杉花粉含有很多種變應(yīng)原，除公認(rèn)的Cry j 1和Cry j 2兩種主要變應(yīng)原外，CJP-6是在其提取物中發(fā)現(xiàn)的第三種主要變應(yīng)原，是一種異黃酮還原酶，與同屬于異黃酮還原酶家族的其他變應(yīng)原序列同源性很高。本研究在國(guó)內(nèi)首次成功克隆了日本柳杉的cjp-6基因，并成功在原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)。本研究中采用的表達(dá)載體是pET19b，該表達(dá)系統(tǒng)為高表達(dá)系統(tǒng)，其產(chǎn)量可達(dá)到每升細(xì)菌純化50 mg重組變應(yīng)原CJP-6，同時(shí)其所表達(dá)的重組蛋白N端帶有組氨酸標(biāo)簽，便于蛋白的純化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)Ni2+親和層析就可以得到純度很高的CJP-6蛋白，為CJP-6生物制劑的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

本研究中，重組變應(yīng)原CJP-6與日本柳杉花粉過(guò)敏病人血清反應(yīng)的Dot blot結(jié)果表明重組變應(yīng)原具有很高的IgE結(jié)合活性和免疫原性，可作為對(duì)日本柳杉花粉過(guò)敏患者進(jìn)行診斷和特異性免疫治療的候選分子。Kawamoto等［3］報(bào)道，以 Western blot檢測(cè)15位日本柳杉過(guò)敏性患者血清有10位患者與重組變應(yīng)原CJP-6反應(yīng)，血清陽(yáng)性率為67%。而我們以ELISA檢測(cè)了60位日本柳杉過(guò)敏病人的血清，其中32份血清中的IgE與重組變應(yīng)原CJP-6的反應(yīng)，其陽(yáng)性率為53．3%。重組變應(yīng)原CJP-6與日本柳杉花粉過(guò)敏患者反應(yīng)陽(yáng)性率的差異，可能是由于不同的檢測(cè)方法所導(dǎo)致。另外，值得注意的是，CJP-6與中國(guó)過(guò)敏性疾病患者血清反應(yīng)的ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，塵螨或者蒿草過(guò)敏病人血清與重組變應(yīng)原CJP-6的IgE陽(yáng)性率很高，分別為45%和51．6%，且反應(yīng)性平均值與日本柳杉花粉過(guò)敏的患者血清相似。這些結(jié)果說(shuō)明，塵螨變應(yīng)原和蒿草花粉變應(yīng)原與日本柳杉花粉變應(yīng)原CJP-6存在著交叉反應(yīng)性，這可能是由于花粉變應(yīng)原與塵螨或者蒿草花粉中的變應(yīng)原在氨基酸序列、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)或者蛋白質(zhì)功能等方面具有較大的相似性［8，9］。因而，免疫治療螨類吸入性過(guò)敏的制劑是否可以用來(lái)治療花粉過(guò)敏患者，重組CJP-6是否可以用于治療其他變應(yīng)原過(guò)敏患者，從而達(dá)到異病同治的目的，還需要做進(jìn)一步深入的研究。

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