潘愛(ài)珍 易偉民 陳克芳 李建軍

（中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院，廣東廣州510120）

圍絕經(jīng)期（更年期）綜合征是指女性從40歲以后到絕經(jīng)后1年的這一時(shí)期，由于卵巢的衰老導(dǎo)致雌激素分泌功能減退而引起的一系列累及全身多器官的臨床綜合征［1］。筆者的前期臨床研究［2］表明中藥更年寧神方能顯著改善圍絕經(jīng)女性患者血性雌激素水平和臨床癥狀。本實(shí)驗(yàn)研究更年寧神方對(duì)圍絕經(jīng)期大鼠顆粒細(xì)胞凋亡因子caspase-3表達(dá)的影響，探討其作用機(jī)制，為中藥治療圍絕經(jīng)期綜合征提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑更年寧神湯組方：熟地黃20 g，山茱萸肉、女貞子、墨旱蓮、枸杞子、菟絲子、丹參、地骨皮、龜板、珍珠母各15 g，五味子、遠(yuǎn)志、淫羊藿各6 g。購(gòu)自康美中藥飲片廠，水煎并濃縮，相當(dāng)于生藥1.0 g/mL，4℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩＠S愛(ài)（主要成分為7-甲異炔諾酮）。半胱天冬酶-3（caspase-3）和β-actin兔抗鼠多克隆抗體及免疫組化染色試劑盒由廣東雅怡生物工程公司提供。

1.2 動(dòng)物選用自然衰老雌性wister大鼠40只，月齡13～15月，體質(zhì)量（330±20）g，由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2009-0003，經(jīng)陰道脫落細(xì)胞涂片檢查，呈現(xiàn)出無(wú)動(dòng)情周期，確定為圍絕經(jīng)期鼠。飼養(yǎng)條件：二級(jí)實(shí)驗(yàn)室，普通全價(jià)飼料喂養(yǎng)，自由攝水，室溫（24±2）℃，濕度45%～65%。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.3 分組與給藥將大鼠隨機(jī)分為4組：圍絕經(jīng)期大鼠模型組、更年寧神方高劑量組（中藥高劑量組）、更年寧神方低劑量組（中藥低劑量組），西藥利維愛(ài)組。另選5個(gè)月月齡、體質(zhì)量（180±20）g的雌性wister大鼠10只作為青年對(duì)照組（正常組）。更年寧神湯高劑量組給予5.68 g/（kg·d），更年寧神湯低劑量組1.42 g/kg，利維愛(ài)對(duì)照組給予利維愛(ài)溶液0.26 mg/（kg·d），圍絕經(jīng)期對(duì)照組和青年對(duì)照組給予生理鹽水3 mL/（kg·d）。每日給大鼠灌胃1次，連續(xù)4周。大鼠末次給藥24 h后斷頭處死，快速取出雙側(cè)卵巢，經(jīng)液氮速凍后于-70℃冰箱凍存，用于組織蛋白的檢測(cè)。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 Westernblot法檢測(cè)卵巢中Caspase-3蛋白的表達(dá)提取大鼠卵巢總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE轉(zhuǎn)膜，用質(zhì)量濃度為30 g/L（0.03 g/mL）的牛血清白蛋白（BSA）37℃封閉1 h，加入兔抗鼠多克隆抗體（1∶200）37℃孵育1 h。TBST洗膜10 min×3次，TBS洗膜10 min。最后用ALP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶500）37℃孵育1 h。TBST洗膜10 min×3次，TBS洗膜10 min。NBT/BCIP顯色，SageCreation凝膠成像系統(tǒng)分析條帶。以actin作為內(nèi)參照。Caspase-3的表達(dá)水平以caspase-3與actin灰度比值表示。

1.4.2 免疫組化檢測(cè)卵巢Caspase-3蛋白的表達(dá)取大鼠一側(cè)卵巢以中性緩沖甲醛固定24 h，梯度酒精脫水、石蠟切片，水化，血清封閉，Ⅰ抗孵育，Ⅱ抗孵育，加底物，DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，切片脫水，透明，封片。根據(jù)切片中卵巢組織中卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色的深淺分4級(jí)，未被染色的為陰性表達(dá)（-），深棕色為弱陽(yáng)性表達(dá)（+），棕黃色為中度陽(yáng)性表達(dá)（++），棕褐色為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（+++）。為了統(tǒng)計(jì)方便，予以半定量計(jì)分：1、2、3、4、分別對(duì)應(yīng)-、+、++、+++。每張切片至少觀察3個(gè)視野。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS12.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s）表示。成組設(shè)計(jì)資料采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Western blot結(jié)果 圍絕經(jīng)期模型組大鼠卵巢中caspase-3蛋白表達(dá)高于正常組（P＜0.01），說(shuō)明模型選擇能反應(yīng)圍絕經(jīng)大鼠的病理生理表現(xiàn)。更年寧神湯高劑量組、利維愛(ài)組大鼠卵巢中caspase-3蛋白表達(dá)低于模型組（P＜0.01）；中藥高劑量組與中藥低劑量組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中藥高劑量組與利維愛(ài)組比較比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1、圖1。

表1 各組大鼠卵巢組織中caspase-3蛋白表達(dá)比較（±s）

表1 各組大鼠卵巢組織中caspase-3蛋白表達(dá)比較（±s）

與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與中藥低劑量組比較，#P＜0.05。

組別nncaspase-3正常組10100.38±0.04模型組10101.13±0.24*中藥高劑量組10100.46±0.07△△#中藥低劑量組10100.94±0.32利維愛(ài)組10100.41±0.18△△

2.2 免疫組化檢測(cè)結(jié)果 青年組卵巢顆粒細(xì)胞caspase-3蛋白多呈弱陽(yáng)性（+）或陰性（-）表達(dá)，模型組總體上染色較深，呈強(qiáng)陽(yáng)性或陽(yáng)性表達(dá)，更年寧神湯高劑量組和利維愛(ài)組多呈弱陽(yáng)性（+）表達(dá)，更年寧神湯低劑量組呈陽(yáng)性表達(dá)，提示圍絕經(jīng)期組與青年對(duì)照組比較caspase-3蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明圍絕經(jīng)期組卵巢顆粒細(xì)胞caspase-3蛋白表達(dá)明顯高于青年對(duì)照組；更年寧神湯高劑量組、利維愛(ài)組及更年康組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。更年寧神湯高劑量組caspase-3蛋白表達(dá)低于低劑量組（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖1 各組大鼠卵巢組織中caspase-3蛋白Westernblot圖

圖2 各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中caspase-3蛋白表達(dá)免疫組化圖

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，婦女進(jìn)入圍絕經(jīng)期，腎氣漸衰，天癸將竭，沖任二脈虛損。本病以肝腎虧虛為本，臟腑、陰陽(yáng)、氣血失和在發(fā)病中亦起著重要作用。故治療關(guān)鍵重在滋補(bǔ)肝腎，調(diào)和陰陽(yáng)氣血。更年寧神湯方中生地黃、山茱萸肉、女貞子、墨旱蓮、枸杞子、菟絲子可補(bǔ)腎肝脾三臟之陰，五味子、遠(yuǎn)志安神斂汗，龜板、珍珠母滋陰潛陽(yáng)鎮(zhèn)靜，淫羊藿溫腎補(bǔ)陽(yáng)，陽(yáng)中求陰，地骨皮退虛熱，丹參活血化瘀，一味丹參功同四物，麥芽疏肝護(hù)胃，調(diào)和諸藥，全方共具滋陰潛陽(yáng)、清熱除煩、寧心安神的功效。

婦女進(jìn)入圍絕經(jīng)期卵巢功能衰退，卵泡閉鎖加劇，卵泡數(shù)量急劇減少，雌激素分泌減少，卵巢漸趨停止排卵。顆粒細(xì)胞為卵巢的主要功能細(xì)胞，其增殖與分化直接影響卵泡的生長(zhǎng)啟動(dòng)、發(fā)育、排卵、黃體形成及甾體激素分泌等卵巢功能活動(dòng)，是卵泡不斷發(fā)育成熟的基本條件［3］。現(xiàn)代研究表明，卵母細(xì)胞的凋亡僅是卵泡閉鎖的開(kāi)始，卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡才是卵泡退化的根本原因［4］。細(xì)胞凋亡的發(fā)生最終依賴于caspaese家族凋亡蛋白酶的活化，它在細(xì)胞凋亡的執(zhí)行過(guò)程中起關(guān)鍵作用［5］。Caspase-3是caspase家族中最重要的凋亡執(zhí)行者之一，在細(xì)胞凋亡的執(zhí)行階段，負(fù)責(zé)對(duì)全部或部分關(guān)鍵性蛋白的酶切（激活或滅活）。Caspase家族的級(jí)聯(lián)反應(yīng)是調(diào)控凋亡的共同通路。卵巢閉鎖及黃體萎縮退化時(shí)發(fā)生細(xì)胞凋亡，特別是顆粒細(xì)胞，所以考察大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡促進(jìn)因子Caspase-3表達(dá)變化對(duì)于了解性腺細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制有一定意義。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果 顯示，caspase-3蛋白在模型組表達(dá)較高，免疫組化顯示其顏色較深，與正常對(duì)照組相比有顯著差異，中藥高劑量組更年寧神湯治療后，caspase-3蛋白其表達(dá)明顯降低，與模型組比較有極顯著差異，與利維愛(ài)組療效相當(dāng)，低劑量組與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明更年寧神湯治療圍絕經(jīng)期綜合征呈量效正比關(guān)系，其作用機(jī)制可能是通過(guò)降低Caspase-3蛋白的表達(dá)抑制卵巢細(xì)胞凋亡，從而起到延緩卵巢老化進(jìn)程，從分子水平探討中藥復(fù)方更年寧神湯對(duì)圍絕經(jīng)期衰老卵巢功能影響的可能機(jī)制。由此推斷，更年寧神湯對(duì)衰老卵巢功能的保護(hù)機(jī)制可能與抑制細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。

［1］ 王翠霞，陳瑩.補(bǔ)腎復(fù)方對(duì)初老大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2，Bax表達(dá)的影響［J］.中醫(yī)藥學(xué)刊，2005，23（8）：1402-1403.

［2］ 李建軍，潘愛(ài)珍，易偉民.更年寧神湯治療陰虛內(nèi)熱型更年期綜合征72例［J］.中藥材，2008，31（4）：628-630.

［3］ 盧翠玲，楊為巍，胡召元，等.顆粒細(xì)胞的增殖分化及其在卵泡發(fā)育中的作用［J］.科學(xué)通報(bào)，2005，50（21）：2341-2347.

［4］ Johnson AL.Intracellular mechanisms regulating cell survival in ovarian follicles［J］.Anim Reprod Sci，2003，78（3-4）：185.

［5］ 徐曉娟，金沈銳，秦旭化，等.補(bǔ)經(jīng)合劑對(duì)初老大鼠卵巢細(xì)胞Fas，Caspases-3表達(dá)的影響［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2003，23（6）：193.