吳彥青 高 穎 朱陵群 婁麗霞 張東梅

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100700）

血腦屏障（BBB）是機(jī)體參與固有免疫的內(nèi)部屏障之一，維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）正常功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定所必需的一種彌散屏障［1-4］。BBB完整性的破壞已被證明為多發(fā)性硬化（MS）和其理想動物模型即實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)［5-11］，并且在 MS 的發(fā)病過程中起著重要的作用［12］。為進(jìn)一步明確MS血腦屏障功能及結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化，本研究觀察EAE小鼠血腦屏障通透性的動態(tài)變化，探討腦和脊髓內(nèi)緊密連接構(gòu)成蛋白（ZO-1）基因在EAE發(fā)病過程中幾個重要時(shí)間點(diǎn)的動態(tài)表達(dá)變化以及其與血腦屏障功能變化的關(guān)系，并為MS在發(fā)病過程中血腦屏障完整性破壞提供分子結(jié)構(gòu)上的依據(jù)以及下一步可能干預(yù)的途徑。

1 材料與方法

1.1 動物 C57BL/6小鼠購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所， 許可證號：SCXK （京）：2005-0013。 選用 8～10周齡雌性C57BL/6小鼠108只，體質(zhì)量（18.4±0.8）g。實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)在中國中醫(yī)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所二級動物中心飼養(yǎng)室。

1.2 試劑及藥物 MOG35-55多肽（MEVGWYRSPFSRVVHLYNGK）由北京賽百盛生物工程公司合成，純度（HPLC）98.3%；完全弗氏佐劑（CFA）購自美國 sigma公司，批號：049K8700；百日咳毒素（PTX）購自美國sigma公司，批號：P7208；結(jié)核分支桿菌菌（H37RA）購自美國 DIFCO 公司，批號：0172191；POWER SYBR GREEN PCR MASTER試劑購于美國ABI公司，批號：4367659。益腎達(dá)絡(luò)飲（由熟地黃、石菖蒲、梔子、豨薟草等藥物組成），飲片購自北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，常規(guī)方法煎煮，收集濾液并文火煎煮濃縮制成2 g生藥/mL的水提物。醋酸潑尼松，天津力生制藥股份有限公司，批號：081206，用去離子水配制成0.39 mg/mL溶液。

1.3 模型制備 采用MOG35-55抗原免疫C57BL/6小鼠。將等體積的 MOG35-55 水溶液（每 100 μL 含 MOG35-55 200 μg）與完全弗氏免疫佐劑 （每100 μL含結(jié)核桿菌H37RA 500 μg）混合乳化制成油包水的抗原乳劑。于免疫動物當(dāng)日記為第0日，模型組、激素組、中藥組每只小鼠背側(cè)脊柱中線兩側(cè)分四點(diǎn)皮下注射共計(jì)0.2 mL MOG35-55抗原配劑，佐劑組每只小鼠背側(cè)脊柱中線兩側(cè)分四點(diǎn)皮下注射共計(jì)0.2 mL不含MOG35-55的油包水乳劑；注射完配劑30 min后，佐劑組、模型組、激素組、中藥組每只小鼠均腹腔內(nèi)注射0.1 mL（含400 ng PTX）百日咳毒素溶液，48 h后再次腹腔內(nèi)注射0.1 mL PTX溶液1次；正常組小鼠不給予任何藥物干預(yù)。

1.4 分組與給藥 實(shí)驗(yàn)分4個取材時(shí)點(diǎn)，即造模后7 d（發(fā)病前期）、14 d（發(fā)病初期）、24 d（發(fā)病急性期）和 40 d（慢性期）。 實(shí)驗(yàn)前將所有C57BL/6小鼠隨機(jī)分組：正常組（24只）、佐劑組（24只）、模型組（24 只）、激素組（18 只）、中藥組（18 只），共 5 組。 免疫后第7日起，每日給予各組小鼠灌服相應(yīng)的藥物。

1.5 神經(jīng)功能評分 小鼠免疫后，由兩名觀察者采用盲法進(jìn)行神經(jīng)功能評分，觀察時(shí)間為第0日到第40日（共41 d），評分標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)Kono等［13］的5級評分法：0分為小鼠不發(fā)??；1分為小鼠出現(xiàn)尾部張力降低或輕度步態(tài)笨拙；2分為小鼠尾部完全無張力，和（或）中度步態(tài)異常，和（或）姿態(tài)維持缺乏；3分為小鼠肢體明顯力弱；4分為小鼠肢體麻痹或癱瘓；5分為小鼠處于瀕死狀態(tài)。測評分≥1分為發(fā)病動物。評價(jià)EAE發(fā)病嚴(yán)重程度的指標(biāo)包括：每日平均臨床評分、平均起病天數(shù)、疾病指數(shù)及平均最高 評分［14］。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測CD4mRNA的表達(dá) ZO-1及βactin引物均由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

小鼠在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死后，超凈工作臺上快速取大腦和脊髓組織，每組6只，液氮冷凍。取腦或脊髓組織約100 mg，采用異硫氰酸胍一步法抽提組織總RNA。所提總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳確定其完整性，紫外分光光度計(jì)檢測含量和純度。取2.0 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，采用SYBR Green熒光染料技術(shù)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。記錄其循環(huán)閾值（Ct），每個樣品中靶基因的相對mRNA表達(dá)采用相對定量公式2-△△Ct計(jì)算，其中△Ct值＝靶基因Ct值-β-actin Ct值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，組間比較采用單因素方差分析，以（±s）表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 造模后EAE小鼠行為學(xué)觀察結(jié)果 見表2。結(jié)果示各治療組與模型組相比，各治療組的平均起病天數(shù)明顯延遲（P＜0.05），平均最高評分明顯降低（P＜0.05），疾病指數(shù)顯著降低（P＜0.05）。

表2 EAE小鼠神經(jīng)功能評分情況（±s）

表2 EAE小鼠神經(jīng)功能評分情況（±s）

與模型組比較，*P＜0.05。

平均起病時(shí)間（d） 每日平均臨床評分（分）12.33±1.23 3.88±0.80激素治療組疾病指數(shù) 平均最高評分（分）模型組 90.54±30.75 3.21±1.25組 別13.33±1.61* 3.54±1.08中藥治療組 14.33±1.97* 3.50±0.81 62.14±25.46* 2.00±0.77*67.29±25.80* 2.13±0.83*

2.2 造模后EAE小鼠腦和脊髓內(nèi)ZO-1 mRNA的表達(dá) 見表3～表4。與正常組比較，免疫后7 d，EAE小鼠腦內(nèi)ZO-1 mRNA的表達(dá)顯著降低（P＜0.05），而脊髓內(nèi)表達(dá)未見顯著改變（P＞0.05）；至免疫后14 d，EAE小鼠腦內(nèi)ZO-1 mRNA的表達(dá)未見顯著改變（P＞0.05），而脊髓內(nèi)表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；免疫后24 d，EAE小鼠腦和脊髓內(nèi)ZO-1 mRNA的表達(dá)繼續(xù)顯著降低（P＜0.05或0.01）；免疫后40 d，EAE小鼠腦內(nèi)ZO-1 mRNA的表達(dá)未見顯著改變（P＞0.05），而脊髓ZO-1 mRNA內(nèi)表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。

經(jīng)過益腎達(dá)絡(luò)飲治療后在14、24、40 d EAE小鼠腦組織ZO-1 mRNA的表達(dá)未見顯著改變（P＞0.05）。中藥治療組EAE小鼠脊髓組織ZO-1 mRNA的表達(dá)在14 d時(shí)與模型組一樣出現(xiàn)顯著降低 （P＜0.05），且與模型組比較未見顯著差異 （P＞0.05）。中藥治療組在24 d和40 d EAE小鼠脊髓中ZO-1 mRNA的表達(dá)與正常組比較均未見顯著改變（P＞0.05）；與模型組比較，在第40日中藥治療組EAE小鼠脊髓中ZO-1 mRNA的表達(dá)顯著增加（P＜0.05）。

經(jīng)過激素治療后在 14、24、40 d EAE小鼠腦組織 ZO-1 mRNA的表達(dá)未見顯著改變（P＞0.05）。在14 d激素治療組EAE小鼠脊髓組織中ZO-1 mRNA的表達(dá)明顯降低（P＞0.05），而在24 d和40 d激素治療組EAE小鼠脊髓組織中ZO-1 mRNA的表達(dá)均未見顯著改變（P＞0.05）。

表3 ZO-1 mRNA在大腦組織中的表達(dá)（ZO-1/β-actin）

表4 ZO-1 mRNA在脊髓組織中的表達(dá)（ZO-1/β-actin）

佐劑組在免疫后7、14、24、40 d EAE小鼠腦和脊髓組織中ZO-1 mRNA的表達(dá)未見顯著改變（P>0.05）。

3 討 論

多發(fā)性硬化及其動物模型EAE是一類主要由T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，T細(xì)胞針對髓鞘成分的反應(yīng)在MS的發(fā)病過程中起到了關(guān)鍵的作用。其主要發(fā)病機(jī)制是某種誘因作用下激活的T細(xì)胞透過BBB進(jìn)入到腦實(shí)質(zhì)結(jié)合中樞的抗原遞呈細(xì)胞抗原，通過再刺激分泌出大量的趨化因子和細(xì)胞因子，進(jìn)一步促使B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活化，募集外周血T細(xì)胞、單核細(xì)胞以及B細(xì)胞等進(jìn)入到炎癥部位，從而導(dǎo)致中樞神經(jīng)軸索的損害以及神經(jīng)組織的炎癥脫髓鞘反應(yīng)［15-16］。

BBB的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)是腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（BMEC），BMEC及BMEC間廣泛的緊密連接（TJ）構(gòu)成了BBB的第一道屏障，有助于維護(hù)腦組織微環(huán)境的穩(wěn)定［17］。TJ是細(xì)胞間的通透屏障，通過細(xì)胞旁路徑調(diào)控水、離子和大分子物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)［18］。TJ蛋白表達(dá)量的改變、位置分布的變化和（或）結(jié)構(gòu)功能的異常均可能破壞TJ的完整性，引起細(xì)胞間連接的開放，導(dǎo)致BBB通透性的改變。TJ由跨膜蛋白、胞質(zhì)附著蛋白（ZO-1等）與細(xì)胞骨架蛋白相連而組成［19-20］。其中ZO-1是緊密連接復(fù)合體中一個非常重要的結(jié)構(gòu)蛋白，它一端與胞內(nèi)側(cè)的細(xì)胞骨架蛋白相連接，另一端又連接著跨膜蛋白，起到一個重要連接樞紐的作用［21-22］；其下游與細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)相關(guān)酶類和細(xì)胞激動蛋白相連接，其表達(dá)水平以及活性的降低均可以影響到細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和功能的完整性［23］。因此，ZO-1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織內(nèi)水平的變化與血-腦屏障的損傷程度具有相關(guān)性，可反映血腦屏障緊密連接的狀態(tài)，從而作為血腦屏障破壞的標(biāo)志［24-25］。

本實(shí)驗(yàn)觀察了EAE小鼠腦和脊髓內(nèi)ZO-1 mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)免疫后7 d，腦內(nèi)ZO-1 mRNA表達(dá)出現(xiàn)顯著下降，而脊髓內(nèi)表達(dá)下降不明顯；免疫后14、24、40 d脊髓內(nèi)的ZO-1 mRNA表達(dá)均顯著低于正常值，脊髓內(nèi)ZO-1 mRNA表達(dá)減少的趨勢與神經(jīng)功能的評分的升高趨勢相符。中藥復(fù)方益腎達(dá)絡(luò)飲可以顯著改善EAE模型小鼠神經(jīng)功能評分，與正常組相比，激素組、中藥組在免疫后14、24、40 d ZO-1 mRNA的EAE小鼠大腦以及免疫后14、24、40 d ZO-1 mRNA的EAE小鼠脊髓中表達(dá)均未見顯著改變，其干預(yù)EAE的作用機(jī)制可能與血腦屏障緊密連接蛋白調(diào)節(jié)有關(guān)。

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