葛姍姍 吳建濃 朱英 郭鑫艷

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江杭州310053）

腸道黏膜通透性（IP）是指腸黏膜上皮容易被某些物質(zhì)分子以非載體或通道介導(dǎo)的被動擴(kuò)散方式通過的特性。在病理狀態(tài)下，腸黏膜屏障功能可能受損，IP增高，腸道內(nèi)毒素及細(xì)菌進(jìn)入體內(nèi)，可促進(jìn)疾病的進(jìn)展或出現(xiàn)并發(fā)癥［1-2］。利用不被體內(nèi)代謝的大分子糖類乳果糖（L）/甘露醇（M）排出比值測定腸黏膜通透性，評估腸黏膜的完整性，是一種無創(chuàng)性診斷腸黏膜屏障功能的方法 。本研究建立高效液相蒸發(fā)光散射（HPLCELSD）測定人尿樣品中乳果糖和甘露醇含量的方法 ，并對膿毒癥患者的IP進(jìn)行檢測。

1 材料

1.1 主要儀器美國Waters公司1525高效液相色譜儀，配備Binary泵、進(jìn)樣器、柱溫箱、ELSD2424檢測器；色譜柱：Lichroshen NH2柱（4.6 mm×250 mm，5 μm江蘇漢邦科技有限公司）；數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

1.2 試劑乳果糖標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所，批號100057-200601）、甘露醇標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品鑒定研究院，批號10053-201103），D-402弱酸性陽離子交換樹脂（常州華特有限公司）。

2 方法 與結(jié)果

2.1 標(biāo)本采集共18例樣品，納入標(biāo)準(zhǔn)：進(jìn)入本院ICU病房的膿毒癥患者且治療時間超過72 h者。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除腎功能不全、已知IP升高原因（如已知原發(fā)性小腸疾病、消化性潰瘍、腸系膜缺血或感染性腸道疾?。?；前30 d內(nèi)有使用非甾體類消炎藥物的記錄；預(yù)計要使用甘露醇或乳果糖作為治療的一部分；及進(jìn)入其他臨床研究者且隨機(jī)分成常規(guī)治療組和常規(guī)治療結(jié)合針灸組各9例。常規(guī)治療組分別為樣1～樣9，常規(guī)治療結(jié)合針灸組分別為樣10～樣18。各試驗(yàn)對象實(shí)驗(yàn)前晚禁食，次日晨排空膀胱后，給予口服或胃管內(nèi)注入糖探針（乳果糖甘露醇混合液50 mL，含乳果糖10 g，甘露醇5 g），留取口服糖探針6 h內(nèi)的全部尿液，計量，混勻后取10 mL，滴入2%硫柳汞4滴防腐處理，置零下30℃冰箱保存待檢。5 d后再按上述步驟收集尿液。2.2標(biāo)本預(yù)處理取尿樣0.8 mL，4℃（12000 r/min）離心30 min；取上清液，并加入約50 mg D-402弱酸性陽離子交換樹脂，混旋，離心，將已被吸附離子后的上清液再經(jīng)孔徑為0.22 μm的水系濾膜過濾后，上機(jī)檢測。

2.3 色譜條件及色譜圖柱溫室溫，流動相：V乙腈︰V水（75︰25）。流速1.1 mL/min，ELSD檢測器漂移管溫度為60℃。噴霧器：加熱，動力60%。氣體壓力：30 psi。電信號放大系數(shù)：2。撞擊器：關(guān)。在上述色譜條件下，甘露醇和乳果糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，尿樣中組分均能實(shí)現(xiàn)基線分離，峰形良好。甘露醇和乳果糖的保留時間分別為8.635min和13.7040 min。見圖1～圖6。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

2.4.1 甘露醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及線性關(guān)系精密稱取甘露醇標(biāo)準(zhǔn)品79.30 mg，用蒸餾水配制成7.93 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。精密量取甘露醇儲備液，分別配制成濃度為39.65、79.3、158.6、317.2、634.4、1268.8、2537.6μg/mL的溶液。取以上7種濃度的甘露醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣20 μL，以其峰面積的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（μg）的對數(shù)值為橫坐標(biāo)做線性回歸。結(jié)果 表明，甘露醇雙對數(shù)線性方程為logy=1.2895logx+3.4952（r=0.9995），進(jìn)樣量線性范圍為39.65～2537.6 μg/mL。

圖1 未給予糖探針空白尿樣色譜圖

圖2 甘露醇和乳果糖標(biāo)準(zhǔn)對照品色譜圖

圖3 常規(guī)組樣4第1日尿樣圖譜

圖4 常規(guī)組樣4第5日尿樣圖譜

圖5 常規(guī)治療結(jié)合針灸組樣8第1日尿樣色譜圖

圖6 常規(guī)治療結(jié)合針灸組樣8第5日尿樣色譜圖

2.4.2 乳果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及線性關(guān)系精密稱取乳果糖標(biāo)準(zhǔn)品50.01 mg，用蒸餾水配制成5.01 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。精密量取乳果糖儲備液，分別配制成濃度為25.05、50.1、100.2、200.4、400.8、801.6、1603.2 μg/mL的溶液。取以上7種濃度的乳果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣20 μL，以其峰面積的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（μg）的對數(shù)值為橫坐標(biāo)做線性回歸。結(jié)果 表明，乳果糖的雙對數(shù)線性方程為logy=1.0624logx+3.6359（r=0.9993），進(jìn)樣量為25.05～1603.2 μg/mL。

2.5 精密度取一份樣品同一日重復(fù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣20 μL，測定峰面積，計算甘露醇和乳果糖的日內(nèi)精密度（RSD），結(jié)果 分別為1.52%和1.95%。同批樣品連續(xù)測定6 d，每次進(jìn)樣20 μL，測定峰面積，計算甘露醇和乳果糖的日間精密度（RSD），結(jié)果 分別為1.59%和1.37%。結(jié)果 表明試驗(yàn)的精密度良好。

2.6 重復(fù)性準(zhǔn)確量取同一份樣品0.8 mL各6份，按2.2項(xiàng)下方法 處理，按2.3色譜條件進(jìn)行分析，計算甘露醇和乳果糖的含量，結(jié)果 甘露醇的平均含量為0.88 mg，RSD為1.04%，乳果糖的平均含量為0.66 mg，RSD為2.56%。

2.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn)將同一患者的6 h尿樣中甘露醇和乳果糖排出量測定3次，取平均值為尿樣中原糖的含量。準(zhǔn)確量取該份樣品0.8 mL各9份，加入高中低3個含量的甘露醇和乳果糖標(biāo)準(zhǔn)品，每個含量配制3份，按2.2項(xiàng)處理后按2.3色譜條件進(jìn)樣分析，計算平均回收率，結(jié)果 見表1。

表1 甘露醇加樣回收率實(shí)驗(yàn)測定表

2.8 樣品含量測定準(zhǔn)確量取各樣品0.8 mL按2.2項(xiàng)下方法 制備供試品，按2.3色譜條件進(jìn)行分析，各樣品分別平行測定3份，計算甘露醇和乳果糖的平均含量、RSD和L/M比值，結(jié)果 見表3～7。常規(guī)治療組受試者第1日和第5日的L/M測定值分別為（0.920±0.0200）和（0.520±0.170）；常規(guī)治療結(jié)合針灸組受試者第1日和第5日的L/M測定值分別為（1.410±0.5200）和（0.770±0.460）。結(jié)果 表明不論是常規(guī)治療組還是常規(guī)治療結(jié)合針灸組，治療5 d后尿液中乳果糖含量變化顯著，而甘露醇變化甚微。常規(guī)治療組的IP出現(xiàn)了顯著變化，而常規(guī)治療結(jié)合針灸組的IP出現(xiàn)極顯著變化。常規(guī)治療結(jié)合針灸組和常規(guī)治療組相比，尿液中乳果糖含量差異較小，但甘露醇變化極顯著，IP差異較大。證明常規(guī)治療結(jié)合針灸能更好的改善患者的IP。

表2 乳果糖加樣回收率實(shí)驗(yàn)測定表

表3 常規(guī)治療組第1日甘露醇及乳果糖平均含量（n=3）

表4 常規(guī)治療組第5日甘露醇及乳果糖平均含量（n=3）

3 討論

乳果糖和甘露醇在人體腸道內(nèi)屬于被動吸收。在正常情況下，不易被腸道吸收，代謝不活潑，在尿液中含量較小，等量排出，無毒性，不易被機(jī)體免疫系統(tǒng)識別。藥物無異味，患者能接受。在病理情況下，腸黏膜受損，細(xì)胞間的緊密連接處破壞、間隙擴(kuò)大，通透性增加，通過細(xì)胞旁道吸收乳果糖（L），易于穿過，吸收量明顯增加，穿過小腸上皮細(xì)胞水溶性微孔吸收的甘露醇（M），其吸收量變化甚微，L與M的比值增大。

表5 常規(guī)治療結(jié)合針灸組第1日甘露醇及乳果糖平均含量（n=3）

表6 常規(guī)治療結(jié)合針灸組第5日甘露醇及乳果糖平均含量（n=3）

表7 常規(guī)治療組和常規(guī)治療結(jié)合針灸組尿中乳果糖和甘露醇排泄率及比值（L/M）表（±s）

表7 常規(guī)治療組和常規(guī)治療結(jié)合針灸組尿中乳果糖和甘露醇排泄率及比值（L/M）表（±s）

與常規(guī)組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與第1日的尿樣比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別第1日第5日常規(guī)組L0.067±0.0100.046±0.0140*（n=9）M0.075±0.0130.090±0.0168 L/M0.920±0.0200.520±0.170*針灸組L0.069±0.0120.045±0.015*（n=9）M0.055±0.0200.073±0.025△L/M1.410±0.520△0.770±0.460**△

尿液經(jīng)低溫高速離心和微孔濾膜過濾后，能基本除去尿液中的蛋白質(zhì)，是比較理想的去蛋白質(zhì)方法 。但是尿液中還含有一定的離子，需要用弱酸性陽離子交換樹脂予以去除。

測定糖類物質(zhì)，HPLC法中使用的色譜柱有專用糖分析柱NH2柱。專用糖分析柱條件苛刻，本實(shí)驗(yàn)使用了NH2改性柱，可以通過改變乙腈與水的比例，使乳果糖和甘露醇的保留時間有所改變，減少流動相中乙腈的量或提高水的比例能使乳果糖和甘露醇的洗脫時間提前。但是會使分離度降低，而且水的比例過大會造成氨基柱的損傷。綜合考慮以上因素，當(dāng)乙腈和水的體積比為75︰25，流速為1.1 mL/min時，分離效果令人滿意。

而ELSD是一種新型的通用型質(zhì)量檢測器，幾乎對所有樣品成分有響應(yīng)，且對不同化合物的響應(yīng)差別較小，能檢測揮發(fā)性比流動相低的任何樣品，可以在很大程度上克服HPLC-IR檢測方法 的不足。ELSD檢測器的參數(shù)主要有漂移管溫度和載氣流速。漂移管溫度影響檢測器的響應(yīng)，溫度低時流動相蒸發(fā)不完全，溫度升高，流動相蒸發(fā)趨于完全，信噪比提高，但溫度過高會使流動相沸騰，增加背景噪音，還可導(dǎo)致組分部分氣化，信號響應(yīng)值變小，只有溫度在流動相基本蒸發(fā)完全的基礎(chǔ)上，產(chǎn)生可以接受的噪音的最低溫度。一般來說，載氣流速越小，形成的溶質(zhì)顆粒越大，散射光的強(qiáng)度越大，但是當(dāng)載氣流速太小時，流動相蒸發(fā)不完全，背景噪音大，最優(yōu)的載氣流速影視在產(chǎn)生可接受噪音的基礎(chǔ)上，產(chǎn)生最大響應(yīng)值的最低流速。因此可以選擇HPLC-ELSD來測定尿液中甘露醇和乳果糖的含量。通過與正常人的L/M值或者不同方法 治療前后L/M比值的變化來比較患者的IP，判斷治療方法 對人IP的影響，從而更好的將治療方法 應(yīng)用于臨床。

［1］ 陳丹，姜春燕，馬辰.HPLC-ELSD法測定尿液中甘露醇和乳果糖濃度［J］.感染、炎癥、修復(fù)，2007，8（2）：79-82.

［2］ 劉放南，譚力，羅楠.高效液相色譜法檢測尿乳果糖/甘露醇排出比值及成人正常值［J］.腸外與腸內(nèi)營養(yǎng)，2004，11（4）：237-238.

［3］ 楊建榮，宋懷宇，姜春華，等.高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法測定人腸黏膜通透性的方法 學(xué)及臨床應(yīng)用研究［J］.廣西醫(yī)學(xué)，2009，12（31）：1751-1755.

［4］ 宋懷宇，姜春華，楊建榮，等.液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法測定人腸黏膜通透性的方法 學(xué)研究［J］.臨床消化病雜志，2008，20（6）：349-352.