左北梅，高文遠(yuǎn)，董艷艷，劉輝，王娟

(1.天津科技大學(xué)，天津 300457；2.天津大學(xué) 藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津 300072；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193)

藥用植物人參的組織培養(yǎng)研究進(jìn)展

左北梅1，高文遠(yuǎn)2*，董艷艷3，劉輝1，王娟2

(1.天津科技大學(xué)，天津 300457；2.天津大學(xué) 藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津 300072；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193)

從人參愈傷組織培養(yǎng)、人參細(xì)胞懸浮培養(yǎng)、人參體細(xì)胞胚胎培養(yǎng)、人參毛狀根培養(yǎng)、人參不定根培養(yǎng)等方面，綜述了人參組織培養(yǎng)的研究進(jìn)展，為人參資源的研究提供參考。

人參；愈傷組織；懸浮細(xì)胞；體細(xì)胞胚胎；毛狀根；不定根

人參PanaxginsengC.A.Meyer為五加科人參屬珍貴藥用植物，其根可入藥，被譽(yù)為藥中之王。含有多種人參皂苷、人參多糖等多種物質(zhì)，可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)各種應(yīng)激刺激的非特異抵抗力，具有抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、保肝護(hù)肝、抗腫瘤等多種醫(yī)療保健功效[1]。由于人參重要的藥用價(jià)值，也成為組織培養(yǎng)的熱點(diǎn)研究植物，本文綜述了人參組織培養(yǎng)的主要研究成果，為人參資源的研究提供參考。

1 人參愈傷組織培養(yǎng)的研究

可用于誘導(dǎo)人參愈傷組織采用的外植體主要是人參的根、莖、葉片、葉柄、花藥、花絲、子房、果肉、原生質(zhì)體等，以根和莖作為外植體最為常見(jiàn)。早在1964年，中國(guó)科學(xué)院植物生理研究所羅士韋教授首先采用人參根為外植體，培養(yǎng)于改良的Heller培養(yǎng)基中形成了愈傷組織，繼代培養(yǎng)移植4次取得成功[2]。1968年，Butenko等成功從人參葉柄、葉片、花冠柄和根的外植體上誘導(dǎo)出愈傷組織。隨后，美國(guó)、日本、印度、朝鮮等國(guó)家相繼開(kāi)展了人參組織培養(yǎng)的研究，促使人參愈傷組織培養(yǎng)的研究在全球開(kāi)展起來(lái)。

朱蔚華教授等[3]報(bào)道不同培養(yǎng)基上人參愈傷組織誘導(dǎo)頻率和生長(zhǎng)速度的不同。人參愈傷組織適宜的培養(yǎng)基為附加10 %的Whise、MS、修改FOX，其中以修改FOX培養(yǎng)墓愈傷組織誘導(dǎo)率最高，愈傷組織生長(zhǎng)速度以SH培養(yǎng)基最快。而人參愈傷組織誘導(dǎo)和培養(yǎng)用得最多的培養(yǎng)基是MS基本培養(yǎng)基，采用MS、N6、B5、Bla·es、I、FOX和修改MS等培養(yǎng)基均能獲得愈傷組織。

大量研究集中在植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)人參愈傷組織培養(yǎng)各階段調(diào)節(jié)作用。古谷力[4]研究證實(shí)，2,4-D的最適濃度為0.5～2 mg·L-1對(duì)人參愈傷組織的誘導(dǎo)具有良好的效果。朱蔚華等[5]指出：適當(dāng)濃度的2,4-D對(duì)人參愈傷組織生長(zhǎng)有顯著的效果，最適濃度為5 mg·L-1。6-BA對(duì)人參愈傷組織的生長(zhǎng)也有一定的促進(jìn)作用，以0.1 mg·L-1生長(zhǎng)最快。郭生禎等[6]進(jìn)一步比較了不同種類(lèi)激素的濃度對(duì)人參愈傷組織誘導(dǎo)的影響。確定了誘導(dǎo)愈傷組織使用的激素，2,4-D起了主導(dǎo)作用，最適濃度為0.5～2 mg·L-1，如過(guò)低或過(guò)高，誘導(dǎo)頻率呈下降趨勢(shì)；NAA對(duì)誘導(dǎo)愈傷組織也有一定的作用，以2～6 mg·L-1較適宜，低于此濃度愈傷組織則很少發(fā)生；其他激素如IAA、6-BA、CA等配合使用，也能獲得較好的效果，但作用不顯著。

另外，田鵬瑋等[7]對(duì)草酸促進(jìn)人參愈傷組織細(xì)胞生長(zhǎng)和人參多糖與皂苷積累進(jìn)行了研究，指出光照和培養(yǎng)溫度對(duì)草酸的誘導(dǎo)效果有很大影響，其中在12 h·d-1的光照下，0.01～1 mmol·L- 1的草酸對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和皂苷積累都有促進(jìn)作用，然而，10 mmol·L- 1的草酸對(duì)多糖積累有促進(jìn)作用；在4個(gè)溫度(22,24,26,28 ℃)水平下，隨著培養(yǎng)溫度的升高,添加草酸對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用增強(qiáng)，但有利于多糖和皂苷的積累。張磊等[8]研究了NO供體硝普鈉(SNP)在光照脅迫下對(duì)人參愈傷組織細(xì)胞生長(zhǎng)及次生代謝積累的影響，利用人參愈傷組織培養(yǎng)體系，給予光照5 000 lx，每天8 h光照，通過(guò)在不同時(shí)間向培養(yǎng)基中添加不同濃度的SNP溶液，結(jié)果表明強(qiáng)光對(duì)人參愈傷組織的危害程度降低，酶活性及次生代產(chǎn)物的積累明顯增加。

此外，人胰島素已在人參愈傷組織細(xì)胞中成功表達(dá)。汪春義等[9]將已構(gòu)建成的植物表達(dá)載體PB1 121/( CTB BA )轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404，通過(guò)農(nóng)桿菌與人參愈傷組織的共培養(yǎng)，將人胰島素基因整合到人參愈傷組織細(xì)胞中，對(duì)其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，并用小鼠進(jìn)行降糖試驗(yàn)。結(jié)果表明，Western blot檢測(cè)顯示，在相對(duì)分子質(zhì)量約17000處有特異蛋白反應(yīng)帶。ELISA法檢測(cè)人胰島素表達(dá)量為5.31 μIU·mL-1。小鼠降糖試驗(yàn)表明人參愈傷組織細(xì)胞有降血糖的作用，而轉(zhuǎn)化的人參愈傷組織細(xì)胞降血糖作用更明顯，成功建立了表達(dá)人胰島素的人參愈傷組織細(xì)胞系。

許多學(xué)者對(duì)影響愈傷組織誘導(dǎo)和生長(zhǎng)所添加的外源激素、最適培養(yǎng)基、培養(yǎng)基的天然補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、水質(zhì)等因子進(jìn)行了考察。然而，人參愈傷組織生長(zhǎng)較為緩慢，在固態(tài)培養(yǎng)基中操作起來(lái)較為復(fù)雜，培養(yǎng)物中的活性成分含量也一般大大低于天然植株，這些都大大限制了其在大規(guī)模生產(chǎn)中的應(yīng)用。

2 人參細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的研究

植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的研究是植物組織培養(yǎng)走向工業(yè)化生產(chǎn)的重要步驟。與植物愈傷組織的固體靜止培養(yǎng)相比，植物細(xì)胞液體懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)主要是細(xì)胞增殖速度快、能提供大量均勻一致的培養(yǎng)物以及能進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。早在20世紀(jì)80年代日本就已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了人參細(xì)胞的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

人參細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的研究主要包括以下幾方面：優(yōu)良細(xì)胞株的篩選、影響細(xì)胞生長(zhǎng)及活性成分含量因素的探討、誘導(dǎo)子的應(yīng)用、活性成分的分離和化學(xué)分析、細(xì)胞培養(yǎng)物的藥理藥效學(xué)研究、生物反應(yīng)器的研發(fā)以及發(fā)酵成本的降低等。對(duì)藥用植物懸浮細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)說(shuō)，選擇適宜培養(yǎng)基是植物細(xì)胞培養(yǎng)的首要條件，通過(guò)培養(yǎng)基中養(yǎng)分的調(diào)節(jié)可改變植物細(xì)胞生長(zhǎng)及物質(zhì)合成能力。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，除了物種本身特性外，還有環(huán)境中的許多物理因素，如光照、溫度、pH值、電磁場(chǎng)等和化學(xué)因素，如培養(yǎng)基中碳氮磷源組成、溶氧、激素以及一些微量的金屬離子等，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物的合成具有很大的影響。

高日等[10]通過(guò)研究人參細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)基蔗糖濃度、MS濃度、氮濃度及硝態(tài)氮與銨態(tài)氮比例對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及皂苷合成的影響，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加30 g·L-1蔗糖時(shí)，人參細(xì)胞合成皂苷能力最強(qiáng)，蔗糖濃度過(guò)低(10 g·L-1)或過(guò)高(70 g·L-1)均不利于細(xì)胞干重增加及皂苷積累。MS培養(yǎng)基濃度減半(0.5MS)或維持原濃度(1.0 MS)，總氮濃度為30 mm時(shí)，有利于人參細(xì)胞皂苷的合成。MS培養(yǎng)基中硝態(tài)氮促進(jìn)皂苷合成，單獨(dú)使用硝態(tài)氮(NO3+/NH4+30∶0)比與銨態(tài)氮混用或單獨(dú)使用銨態(tài)氮(NO3+/NH4+為0∶30)更有利于皂苷的合成，皂苷生產(chǎn)量達(dá)到最高(158.9 mg·L-1)。有的學(xué)者對(duì)人參細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中的激素調(diào)節(jié)及細(xì)胞分裂進(jìn)行了相關(guān)研究，指出在人參細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中，單獨(dú)使用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑時(shí)2 mg·L-12,4-D和2 mg·L-1NAA的效果較好。在不同激素組合的試驗(yàn)中，以2 mg·L-12,4-D+2 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1KT的效果最好[11]。

1990年，丁家宜等人首次研究了人參培養(yǎng)細(xì)胞的多糖類(lèi)有效成分。袁靜芳等[12]在人參細(xì)胞培養(yǎng)物中水溶性多糖的研究中，經(jīng)醋酸纖維素薄膜電泳和瓊脂糖凝膠電泳，證明DPSCG1和DPSCG2均為一性多糖，兩者經(jīng)水解和薄層層析結(jié)果均由L-鼠李糖、D-木糖、D-阿拉伯糖、D-半乳糖和D-半乳糖醛酸等組成，但兩種多糖各有一個(gè)Rr值相同的未鑒定組成成分，有待進(jìn)一步研究。

胡卓逸等[13]測(cè)定了不同培養(yǎng)期的人參細(xì)胞培養(yǎng)物(CMGC)中超氧化歧化酶(SOD)的活力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同培養(yǎng)期CMGC中SOD的活力不同，培養(yǎng)21 d的樣品中單位鮮重酶活力單位和蛋白質(zhì)含量均為最高。這些學(xué)者還測(cè)定了不同生長(zhǎng)期的人參細(xì)胞培養(yǎng)物中過(guò)氧化氫酶的活力，結(jié)果表明此酶活力隨人參細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間而異，酶的單位鮮重活力從10 d到21 d內(nèi)較快升高，在抽樣測(cè)定中以21 d時(shí)為最高，約為188 μ·mg-1人參細(xì)胞培養(yǎng)物[14]。

人參細(xì)胞懸浮培養(yǎng)較固體培養(yǎng)周期短、生長(zhǎng)速度快、皂苷含量比固體培養(yǎng)高都己得到了證實(shí)，這些特點(diǎn)也決定了其在工廠化生產(chǎn)上的潛力要大于固體培養(yǎng)。適合植物細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器的研發(fā)是實(shí)現(xiàn)植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的前提。目前應(yīng)用于人參細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)人參皂苷的生物反應(yīng)器主要有機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器、氣升式生物反應(yīng)器、固體床生物反應(yīng)器以及流化床生物反應(yīng)器等[15]。為了更有利于人參細(xì)胞的培養(yǎng)，人們對(duì)現(xiàn)有反應(yīng)器的攪拌形式、葉輪結(jié)構(gòu)以及空氣分布器進(jìn)行了改進(jìn)，力求在滿(mǎn)足供氧、混合的要求的同時(shí)減小剪切力。

3 人參體細(xì)胞胚胎的研究

體細(xì)胞胚胎發(fā)生是單細(xì)胞或一群細(xì)胞被誘導(dǎo)不斷再生非合子胚,并萌發(fā)形成完整植株的發(fā)育過(guò)程。在自然條件下,這個(gè)發(fā)育過(guò)程一般不可能發(fā)生,但通過(guò)組織培養(yǎng),體細(xì)胞胚胎發(fā)育非常頻繁,成為除器官發(fā)生以外再生完整植株的又一條途徑。體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)不僅是植物快繁的重要體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)，而且也已發(fā)展成為研究植物胚胎發(fā)生機(jī)理遺傳轉(zhuǎn)化的重要方法，它在研究植物形態(tài)建成的分子和細(xì)胞機(jī)制等基礎(chǔ)研究方面還是一個(gè)重要工具，在藥用植物上的應(yīng)用日益受到重視。

Monteiro M[16]在2001年的研究表明亞精氨在人參體細(xì)胞胚胎發(fā)生的起始階段起到了特殊作用；Choi Y E等[17]的研究表明，在高濃度NH4NO3存在的條件下，可以通過(guò)從人參胎盤(pán)母面絨毛小葉誘導(dǎo)而來(lái)的人參愈傷組織來(lái)誘導(dǎo)形成非激素依賴(lài)型體細(xì)胞胚胎；Langhsová L等[18]的研究表明聚乙二酸和脫落酸能夠促進(jìn)人參體細(xì)胞胚胎的成熟和再生；Kim O T等[19]則對(duì)人參體細(xì)胞胚的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。人參體細(xì)胞胚胎的研究為人參再生植株的形成以及人參快速繁殖體系的建立提供了基礎(chǔ)。我國(guó)學(xué)者比較了不同外植體、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)種類(lèi)及配比對(duì)人參體細(xì)胞胚發(fā)生的影響，建立人參胚狀體培養(yǎng)方法并獲得再生植株[20-22]。

4 人參毛狀根培養(yǎng)的研究

Inomata等[23]報(bào)道人參的毛狀根培養(yǎng)沒(méi)有一點(diǎn)延遲期，在培養(yǎng)的前兩周生長(zhǎng)很快，因此通過(guò)每七天更換一次培養(yǎng)基來(lái)保持毛狀根的快速生長(zhǎng)，培養(yǎng)32 d增長(zhǎng)倍數(shù)達(dá)到31倍，是所有報(bào)道的人參培養(yǎng)物中增長(zhǎng)倍數(shù)最高的，在此過(guò)程中，人參皂苷的含量呈現(xiàn)一定的變化，始終高于對(duì)照(不更換培養(yǎng)基的毛狀根)，特別是第14天，總?cè)藚⒃碥?Rg組，Rb組，Ro)含量達(dá)到1.7 %～2.2 %，相當(dāng)于田間栽培5年生人參根中的皂苷含量水平。進(jìn)一步在葉輪片式生物反應(yīng)器(turbine-blade type bioreactor)中采用每7 d更換1次培養(yǎng)基的方法獲得了與搖瓶中類(lèi)似的結(jié)果，培養(yǎng)36 d，收獲毛狀根干重15.8 g·L-1，人參皂苷的含量1.7 %，這一結(jié)果表明該毛狀根株系具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。Jeong G T等[24]研究了SA(salicylic acid)、ASA(acetylsalicylic acid)、酵母、細(xì)菌、鞣酸、硒、硫酸鎳以及氯化鈉等誘導(dǎo)子對(duì)人參毛狀根培養(yǎng)體系中人參皂苷產(chǎn)率的影響。研究表明絕大多數(shù)誘導(dǎo)子能夠促進(jìn)人參皂苷的積累但同時(shí)會(huì)在一定程度上抑制人參毛狀根的生長(zhǎng)。

近幾年來(lái)，我國(guó)對(duì)人參毛狀根的培養(yǎng)也有了一定進(jìn)展。徐立新等[25]通過(guò)向人參毛狀根培養(yǎng)基中添加2,4-D、NAA、IBA、誘導(dǎo)子MJA和SA，研究了5種外源物質(zhì)對(duì)人參毛狀根的生長(zhǎng)量、總皂苷及單體皂苷Rb1的影響。結(jié)果表明，0.5 mg·L-1的IBA能顯著促進(jìn)人參毛狀根的生長(zhǎng)(月增長(zhǎng)量為50.73 g·L-1)和總皂苷(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.31 %)的積累，單體皂苷Rb1(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.293 %)的含量明顯增大，使其在總皂苷中所占的比例增大。并且兩種誘導(dǎo)子對(duì)人參皂苷含量的增加有明顯的協(xié)調(diào)作用，當(dāng)MJA與SA濃度均為0.001 mmol·L-1時(shí)，其對(duì)總皂苷和單體皂苷的積累比二者單獨(dú)作用要大。陳欣等[26]對(duì)人參毛狀根糖基轉(zhuǎn)移酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了相關(guān)研究，人參毛狀根中提取分離了糖基轉(zhuǎn)移酶，用SDS-PAGE測(cè)定其相對(duì)分子質(zhì)量為56.6k，該酶以對(duì)羥基苯甲酸為底物時(shí)的Km= 0.399 nmol· L-1，Vmax= 2.74 nmol·min-1，反應(yīng)的最適溫度為45 ℃，最適pH值為8.0。

5 人參不定根培養(yǎng)的研究

不定根由于沒(méi)有外源基因，在產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)方面更有優(yōu)勢(shì)，幾年來(lái)越來(lái)越受到組織培養(yǎng)研究者的重視。人參不定根可以從體細(xì)胞胚胎進(jìn)一步發(fā)育而形成的再生小植株上分離得到，也可以直接由人參愈傷組織誘導(dǎo)而來(lái)。由人參愈傷組織誘導(dǎo)不定根一般在MS培養(yǎng)基中添加適當(dāng)種類(lèi)和適當(dāng)濃度的外源激素即可。常用來(lái)誘導(dǎo)人參不定根的激素為IBA(indole-3-butyric acid,IBA)。韓國(guó)在人參不定根培養(yǎng)的研究方面取得了重大突破，已經(jīng)達(dá)到了工業(yè)化程度。Paek等[27]在大規(guī)模培養(yǎng)人參不定根生產(chǎn)皂苷的研究中，從人參不定根的誘導(dǎo)到懸浮細(xì)胞的建立，再進(jìn)一步從培養(yǎng)條件，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、誘導(dǎo)子、不同接種量和通氣量等方面考察氣升式生物反應(yīng)器小規(guī)模培養(yǎng)到擴(kuò)大培養(yǎng)的研究，然后中式規(guī)模生產(chǎn)，最后，人參不定根反應(yīng)器培養(yǎng)的規(guī)模達(dá)到了10 t。Choi等[28]報(bào)道了利用5～500 L生物反應(yīng)器規(guī)模化培養(yǎng)人參不定根的中試研究結(jié)果。

我國(guó)近年來(lái)也開(kāi)始了人參不定根的組織培養(yǎng)研究。樸炫春等[29]報(bào)道了利用5 L氣升式生物反應(yīng)器培養(yǎng)人參不定根的生長(zhǎng)周期，考察蔗糖濃度、接種量對(duì)人參不定根培養(yǎng)的影響，但未測(cè)定其皂苷的累積。黃滔等[30]對(duì)搖瓶培養(yǎng)人參不定根系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化。由香玲等[31]對(duì)小型生物反應(yīng)器(3～10 L)培養(yǎng)人參不定根的生長(zhǎng)和人參皂苷(Rg1、Re、Rb1)的累積規(guī)律，以及蔗糖濃度、初始接種量對(duì)其生長(zhǎng)和人參皂苷累積的影響進(jìn)行研究。

6 展望

人參組織培養(yǎng)在細(xì)胞培養(yǎng)和不定根培養(yǎng)方面分別在日本和韓國(guó)實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化，我國(guó)作為一個(gè)資源使用和出口大國(guó)，在注重人參大田栽培的同時(shí)，也應(yīng)當(dāng)在人參組織培養(yǎng)方面早日實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，我們不能長(zhǎng)久地靠砍伐山林來(lái)為世界提供廉價(jià)的人參資源，而應(yīng)當(dāng)在新技術(shù)的應(yīng)用方面走在全國(guó)的前列。

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*高文遠(yuǎn)，E-mail: pharmgao@tju.edu.cn

2011-12-06)