鄭司浩，孫稚穎，黃林芳*

(1.中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355)

麥冬及其混偽品的ITS2序列分析及鑒別研究

鄭司浩1，孫稚穎2，黃林芳1*

(1.中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355)

目的對(duì)麥冬及其易混偽品進(jìn)行分子鑒別，以確保該藥材的質(zhì)量和臨床安全用藥。方法從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載麥冬及其混偽品的ITS2片段序列，利用MEGA等軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)分析，構(gòu)建NJ樹，并預(yù)測(cè)麥冬及其混偽品的ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)果麥冬與其3個(gè)混偽品的ITS2序列間存在明顯差異，基于ITS2序列的NJ樹及其二級(jí)結(jié)構(gòu)亦能對(duì)麥冬及其混偽品進(jìn)行鑒別。結(jié)論ITS2條形碼序列可有效地鑒別麥冬及其混偽品。

麥冬；混偽品；ITS2；分子鑒定；DNA條形碼

藥材麥冬(Ophiopogonis Radix),又名沿階草、書帶草、麥門冬，為百合科植物麥冬(Ophiopogon japonicus (L.f) Ker-Gawl.)的干燥塊根[1]。麥冬性甘、微苦，微寒，有養(yǎng)陰生津，潤(rùn)肺清心之功效，用于肺燥干咳，陰虛癆嗽，喉痹咽痛，津傷口渴，內(nèi)熱消渴，心煩失眠，腸燥便秘等癥。藥理作用研究表明，麥冬在降血糖、抗衰老、抗氧化及改善心腦血管疾病方面作用明顯[2]。由于各地用藥習(xí)慣不同，市場(chǎng)上出現(xiàn)許多麥冬的混偽品，主要有闊葉山麥冬(Liriopemuscari〔Decaisne〕 L.H.Bailey)、山麥冬(Liriopespicata〔Thunberg〕 Loureiro)、石刁柏(AsparagusofficinalisL.)等[3-4]。利用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行藥用植物的鑒定和區(qū)別近年來成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)，其中DNA條形碼鑒定技術(shù)倍受學(xué)術(shù)界關(guān)注[5-7]。DNA條形碼技術(shù)是一種新的生物鑒定方法，它應(yīng)用短的、標(biāo)準(zhǔn)的DNA片段作為物種標(biāo)記。在眾多條形碼中，ITS2片段具有更多優(yōu)點(diǎn)，它在物種水平變異較快、序列片段較短，是最具有潛力的候選DNA條形碼之一[8-12]。本文以ITS2條形碼序列鑒定麥冬及其3種混偽品闊葉山麥冬、山麥冬和石刁柏，以期建立一種快速、有效、準(zhǔn)確的分子鑒定方法，確保其藥材的質(zhì)量及用藥安全。

1 材料與方法

1.1 材料來源

所用ITS2序列從GenBank下載，詳情見表1。

表1 材料來源

1.2 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用MEGA等軟件分析研究樣本的ITS2序列，計(jì)算種內(nèi)種間遺傳距離(K-2P距離)等，并建立NJ樹進(jìn)行物種鑒定。利用Schultz等[13]建立的ITS2數(shù)據(jù)庫及其網(wǎng)站預(yù)測(cè)ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 麥冬種內(nèi)序列變異及分析

麥冬8條種內(nèi)參考序列比對(duì)后長(zhǎng)度為219 bp，種內(nèi)序列變異位點(diǎn)有6處，如圖1所示。麥冬種內(nèi)ITS2序列的平均K-2P距離為0.009 0，最大K-2P距離為0.018 5。

2.2 麥冬種間序列變異及分析

麥冬與其混偽品的序列種間變異位點(diǎn)較多，見圖2。麥冬及其混偽品ITS2序列種間K-2P距離的平均值為0.183 3，最小K-2P距離為0.084 6。

2.3 麥冬及其混偽品ITS2序列NJ樹構(gòu)建及分析

利用系統(tǒng)聚類的方法，基于ITS2序列構(gòu)建NJ樹(見圖3)。從樹圖可以看出，正品麥冬與麥冬屬其他混偽品闊葉山麥冬、山麥冬以及天門冬屬的石刁柏可以有效鑒別開。

圖3 基于ITS2序列構(gòu)建的麥冬與其混偽品的鄰接(NJ)樹

2.4 麥冬及其混偽品ITS2序列二級(jí)結(jié)構(gòu)及分析

利用Schultz等[11]建立的ITS2數(shù)據(jù)庫及其網(wǎng)站預(yù)測(cè)了麥冬及其混偽品的ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)，如圖4所示，通過比較麥冬與其混偽品ITS2序列二級(jí)結(jié)構(gòu)可以看出，麥冬與闊葉山麥冬的ITS2序列二級(jí)結(jié)構(gòu)在螺旋II和IV區(qū)保守，在螺旋I和III區(qū)有差異；麥冬與山麥冬在螺旋II區(qū)保守，在螺旋I、III和IV區(qū)均有差異；麥冬與偽品石刁柏在四個(gè)螺旋區(qū)均有明顯差異。因此，基于ITS2序列預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的比較也可以有效的鑒別麥冬及其混偽品。

圖4 麥冬與其混偽品ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)比較

3 討論

麥冬為我國(guó)常用中藥材，應(yīng)用廣泛，具有重要的藥用價(jià)值。然而其地方習(xí)用品和混偽品市場(chǎng)上較多，導(dǎo)致該藥材在流通和使用中出現(xiàn)混亂。傳統(tǒng)鑒別麥冬的方法有性狀鑒別、顯微鑒別、理化鑒定及薄層色譜等[14-18]，但是存在一定的局限性，主要表現(xiàn)在單一的傳統(tǒng)鑒定方法不能準(zhǔn)確的鑒別麥冬及其混偽品，需多種方法綜合分析，只能為鑒定提供參考依據(jù)。DNA條形碼技術(shù)具有技術(shù)成熟、操作簡(jiǎn)便、迅速、可靠、適合廣泛推廣等優(yōu)點(diǎn)，是一種新的分子生物鑒定技術(shù)。

本文應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)測(cè)定了麥冬及其混偽品的ITS2序列并預(yù)測(cè)了它們的ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)，研究結(jié)果表明，麥冬及其混偽品的ITS2序列變異明顯，種內(nèi)最大遺傳距離(K-2P距離,0.018 5)小于種間最小遺傳距離(0.084 6)；基于ITS2序列建立的NJ樹可以很明顯的把不同來源的麥冬及其混偽品鑒別開來；此外，通過ITS2序列預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)同樣可以從直觀上更好的鑒別麥冬及其混偽品。總之，基于ITS2序列的DNA條形碼技術(shù)可以簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確地鑒定麥冬及其混偽品，對(duì)保障該藥材使用的安全性和有效性具有重要的意義。

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AnalysisandIdentificationofOphiopogonjaponicusandItsAdulterantsUsingITS2Sequences

ZHENG Si-hao1,SUN Zhi-ying2,HUANG Lin-fang1

(1.TheKeyLaboratoryofBioactiveSubstancesandResourcesUtilizationofChineseHerbalMedicine,MinistryofEducationInstituteofMedicinalPlantDevelopment,ChineseAcademyofMedicalSciences,PekingUnionMedicalCollege,Beijing100193China;2.CollegeofChineseMedicine,ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250355,China)

Objective: To analysis the DNA barcodes ofOphiopogonisRadixand its adulterants,and to ensure the quality and clinical safety of drugs.MethodsDownload the ITS2 sequences ofOphiopogonisRadixand its adulterants from GenBank database,and the genetic distances were computed using MEGA 4.0 in accordance with the Kimura 2-Parameter (K2P) model,and the phylogenetic tree was constructed.The ITS2 secondary structure was predicted using the ITS2 database and website founded by Schultz et al.ResultsOphiopogonisRadixand its adulterants can be identified by the differences of the ITS2 sequences.The phylogenetic tree and the ITS2 secondary structure can also distinguish betweenOphiopogonisRadixand its adulterants.ConclusionITS2 barcode sequences can serve as a valuable marker to identifyingOphiopogonisRadixand its adulterants,and it has a broad application prospects in the field of Traditional Chinese Medicine.

Ophiopogonjaponicus;Adulterants;ITS2;Molecular identification;DNA barcoding

*黃林芳,Tel： (010)57833197,E-mail：lfhuang@implad.ac.cn

2011-11-23)