王貴強(qiáng)， 陳 溉， 衛(wèi)茂華，楊盛泉

胃癌是我國(guó)常見的惡性腫瘤。胃癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素參與、多基因變異、多步驟發(fā)生長(zhǎng)期演變的復(fù)雜過程。已有研究顯示，胃癌的發(fā)生和發(fā)展與第10號(hào)染色體丟失的磷酸酶(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN)基因的失活表達(dá)密切相關(guān)［1-2］。目前普遍認(rèn)為，影響胃癌化療效果的主要因素是多藥耐藥性，P糖蛋白(p-glycoprotein，P-gp)介導(dǎo)的多藥耐藥是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥的經(jīng)典途徑。本研究通過檢測(cè)PTEN、P-gp在胃癌、癌旁及正常組織中的表達(dá)及其相關(guān)性，探討PTEN參與胃癌多藥耐藥的可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源 標(biāo)本來自我院2009年1月至2011年1月期間行胃癌根治切除術(shù)的51例患者，其中男23例，女28例;患者年齡36～75歲，中位年齡60歲。低分化組(低分化腺癌、未分化癌、黏液腺癌、印戒細(xì)胞癌)28例，中高分化組(中分化、高分化管狀腺癌及乳頭狀腺癌)23例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移23例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例。浸潤(rùn)未超過漿膜層(T1+T2)25例，浸潤(rùn)超過漿膜層(T3+T4)26例。按2009年第7版UICC的TNM分期:Ⅰ期8例，Ⅱ期14例，Ⅲ期21例，Ⅳ期8例。所有患者術(shù)前未行放化療，術(shù)后病理確診為胃癌。每例均取胃癌組織、距腫瘤邊緣＞5cm的正常組織及距腫瘤邊緣0.5～1.0 cm的癌旁組織(正常及癌旁組織均經(jīng)病理檢查排除腫瘤累及)，以4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后待用。

1.2 方法 采用SP法檢測(cè)標(biāo)本中PTEN、P-gp的表達(dá)，按試劑盒說明操作，多次預(yù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整最佳反應(yīng)條件，以已知陽性切片作為陽性對(duì)照，以0.01 mol/L PBS代替一抗作為空白對(duì)照。鼠抗人PTEN單克隆抗體、鼠抗人P-gp單克隆抗體、SP試劑盒、DAB顯色劑均購(gòu)于北京中杉生物技術(shù)有限公司。

1.3 結(jié)果判定 PTEN陽性為在細(xì)胞核內(nèi)呈棕黃色或黃色顆粒，P-gp陽性為在細(xì)胞漿或細(xì)胞膜中呈棕褐色或黃色顆粒。每例切片選取5個(gè)區(qū)域40倍高倍鏡視野，每個(gè)區(qū)域計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，按陽性細(xì)胞占同類計(jì)數(shù)細(xì)胞的百分比為陽性面積。表達(dá)水平采用染色強(qiáng)度評(píng)分+陽性細(xì)胞面積評(píng)分的積分表示。染色強(qiáng)度分0～3級(jí):0級(jí)為完全陰性，與背景一致;1級(jí)為弱陽性，染色淡黃色略高于背景;2級(jí)為陽性染色，呈黃色，明顯高于背景;3級(jí)為強(qiáng)陽性染色，呈棕褐色。陽性細(xì)胞面積分4級(jí):0級(jí)為陽性細(xì)胞面積小于10%;1級(jí)為10%～25%;2級(jí)為大于25%～50%，3級(jí)為大于50%。以積分0～2為陰性，積分≥3為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間比較用χ2檢驗(yàn)分析，因素相關(guān)性分析用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，以P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTEN與P-gp蛋白的表達(dá) PTEN與P-gp蛋白的陽性表達(dá)見圖1、2。胃癌組織中PTEN表達(dá)陽性率為52.3%，顯著低于癌旁組織(88.2%)和正常組織(96.1%)，χ2分別為 15.30 和 24.98，均 P ＜0.001。P-gp在胃癌組織、癌旁及正常組織中表達(dá)陽性率分別為 57.7%、51.9%、34.6%，胃癌組織中P-gp的陽性率顯著高于正常組織，χ2=5.67，P ＜0.05。

2.2 PTEN與P-gp的表達(dá)與胃癌臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性 PTEN陽性表達(dá)與患者的性別及年齡無明顯相關(guān)性，均P＞0.05;PTEN在胃癌中的表達(dá)與腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期相關(guān)，χ2值分別為 4.65、4.46、5.55、4.46，均 P ＜0.05。P-gp在胃癌組織中的表達(dá)與患者的性別、年齡、腫瘤的分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期均無顯著相關(guān)，均P＞0.05。

圖1 PTEN在癌旁組織中的陽性表達(dá)(SP，×400)

圖2 P-gp在胃癌組織中的陽性表達(dá)(SP，×400)

2.3 胃癌中PTEN表達(dá)與P-gp表達(dá)的相關(guān)性Spearman相關(guān)分析顯示胃癌組織PTEN和P-gp的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，Spearman相關(guān)系數(shù)為 －0.42，P＜0.05，見表1。

表1 PTEN與P-gp表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

PTEN是具有雙重磷酸酶活性的抑癌基因，通過發(fā)揮其蛋白酪氨酸磷酸酶和脂質(zhì)磷酸酶活性作用，脫去多種促瘤生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵酶的磷酸根，降低其磷酸化水平，阻斷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而發(fā)揮抑癌作用［3］。PTEN的失活在胃癌中是一多發(fā)事件，其通過基因突變、刪除、缺失、雜合性丟失、啟動(dòng)子甲基化而失活，進(jìn)而增強(qiáng)蛋白激酶B、焦點(diǎn)粘附激酶、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶的活性，提高腫瘤細(xì)胞的增殖、粘附、遷移能力。我們的研究顯示，胃癌中PTEN的陽性率顯著低于正常及癌旁組織(P＜0.05)，PTEN在癌旁組織中的陽性率低于正常組織，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，此結(jié)果與Yang等［2］的研究結(jié)果相似。從正常胃黏膜到胃癌的演變過程中PTEN的表達(dá)下調(diào)，其抑制腫瘤細(xì)胞增殖分化的能力降低，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生，顯示PTEN在胃癌的發(fā)生過程中起著重要作用。已有的研究表明PTEN在胃癌中的表達(dá)與 VEGF、MMPs呈負(fù)相關(guān)［4］，提示PTEN失活可提高VEGF、MMPs的表達(dá)，促進(jìn)癌細(xì)胞向基質(zhì)浸潤(rùn)及腫瘤血管的形成，為腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移提供條件。我們的研究顯示PTEN的表達(dá)與患者的年齡及性別無明顯相關(guān)，而與腫瘤的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度、pTMN分期顯著相關(guān)，這表明PTEN蛋白表達(dá)水平反映了胃癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移特性，參與了胃癌的發(fā)展，影響胃癌的預(yù)后。

P-gp是MDR-1基因的表達(dá)產(chǎn)物，其外排涉及腫瘤多藥耐藥的主要分子機(jī)制，可作為判斷化療反應(yīng)的獨(dú)立預(yù)后因素。我們的研究顯示P-gp在胃正常、癌旁、癌組織中均有表達(dá)，癌組織顯著高于正常組織，正常胃黏膜中P-gp的表達(dá)是其生理功能的一種表現(xiàn)，是胃黏膜暴露于外界環(huán)境中接觸有毒物質(zhì)后的一種保護(hù)性反應(yīng)，同時(shí)也說明人類本身就存在P-gp基因的表達(dá)，即具有原發(fā)耐藥性;腫瘤細(xì)胞的形成及化療藥物的使用只是增強(qiáng)了這種耐藥性的表達(dá)，說明P-gp在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中也起著重要的作用。

近年的報(bào)道表明抗癌藥物順鉑、多柔比星及紫杉醇等能通過增強(qiáng)PTEN抑癌活性而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡［5］，PTEN基因的活性改變可影響腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，由此推測(cè)PTEN失活在腫瘤化療耐藥中發(fā)揮了重要作用。我們的研究顯示胃癌中PTEN的表達(dá)與P-gp的表達(dá)呈顯著的負(fù)相關(guān)，提示PTEN可能參與了胃癌耐藥性的形成。Han等［6］的研究顯示PI3K/AKT途徑是腫瘤中經(jīng)常被激活的重要細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑，該途徑的激活能上調(diào)磷酸化的AKT的表達(dá)，并通過P-gp和非P-gp介導(dǎo)的機(jī)制來調(diào)節(jié)腫瘤的耐藥性。Garcia等［7］通過分析AKT、MDR-1、NF kappa B的相關(guān)性時(shí)發(fā)現(xiàn)磷酸化的AKT在耐藥株的細(xì)胞系中的表達(dá)高于在化療敏感細(xì)胞系中的表達(dá)，應(yīng)用抑制劑Wortannin和Ly294002能抑制P-gp的功能。PTEN是負(fù)性調(diào)控PI3K/AKT途徑的抑癌基因，胃癌中PTEN的失活將提高AKT的活性，提示PTEN的失活是激活磷酸化的AKT活性的潛在機(jī)制，并可能參與胃癌的多藥耐藥性。Hang等［8］在轉(zhuǎn)染PTEN基因后發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性增強(qiáng)，并能逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞株的耐藥性。我們的研究顯示PTEN與P-gp的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，推測(cè)胃癌中PTEN的失活可能通過激活PI3K/AKT途徑上調(diào)P-gp的表達(dá)，但其確切的機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究。

綜上所述，PTEN失活與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其可作為胃癌病理生物學(xué)行為的判斷指標(biāo)。PTEN的表達(dá)與P-gp表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，其失活可能通過調(diào)節(jié)激活PI3K/AKT途徑上調(diào)P-gp的表達(dá)而參與胃癌的多藥耐藥。

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