朱利斌，張普，黃婷，王永彪

（溫州醫(yī)學(xué)院附屬育英兒童醫(yī)院，浙江 溫州 325027，1.兒外科；2.病理科）

先天性巨結(jié)腸（Hirschprung’s disease，HD）手術(shù)治療效果如何，依賴術(shù)中是否準(zhǔn)確切除病變腸管，但僅憑術(shù)者經(jīng)驗(yàn)，過(guò)多切除正常的腸管，則正常腸管總長(zhǎng)度減少，患兒易患營(yíng)養(yǎng)不良、慢性腹瀉等疾病，而且增加手術(shù)時(shí)間及手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)；反之切除腸管過(guò)少，病變段腸管未完全切除，患兒仍有持續(xù)便秘，需再次手術(shù)，增加患兒的痛苦及經(jīng)濟(jì)上的壓力。因此，在手術(shù)中急需一個(gè)行之有效、快速、規(guī)范、易操控的、客觀的診斷方法。以往的術(shù)中快速診斷方法有：冰凍切片HE染色、乙酰膽堿脂酶（AchE）染色、乳酸脫氫酶（LDH）染色法等，對(duì)腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的有效識(shí)別率不高，操作流程繁瑣，并且診斷依賴于病理科醫(yī)師的主觀經(jīng)驗(yàn)，均不甚理想。本研究改進(jìn)了一種基于NADPH-d的快速組織學(xué)染色方法，供手術(shù)當(dāng)中快速診斷HD，確定腸管切除范圍，介紹如下。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本及分組 本研究所用標(biāo)本均取自手術(shù)中切除腸管，并經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。自2008至2011年37例HD患兒術(shù)中切除的結(jié)腸，其中男27例，女10例，年齡5～19個(gè)月，平均11.6個(gè)月。分?jǐn)U張段、移形段、狹窄段，制片后分批超低溫冰箱保存，以非HD結(jié)腸造瘺切除標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照。分NADPH-d快速染色法組、冰凍切片HE染色法組。

1.2 制片 標(biāo)本常規(guī)冰凍連續(xù)切片，片厚4μm，多聚賴氨酸載玻片貼片，取奇數(shù)切片做NADPH-d的快速組織學(xué)染色，偶數(shù)切片做冰凍切片HE染色。

1.3 NADPH-d的快速組織學(xué)染色方法 反應(yīng)液組成：1 mL 0.1 mol/L PB（pH 8.0）液中加入0.5 mg NADPH-d（Sigma）、0.6 mg NBT（Sigma）、10μL二甲基亞砜（蘇州正興化工研究院）、3μL Triton X-100（北京拜爾迪生物公司）。滴加反應(yīng)液后載玻片置于37 ℃水浴箱中10 min，觀察反應(yīng)液由黃色變微紫色后取出，光鏡下觀察神經(jīng)節(jié)細(xì)胞顯示清晰后PBS沖洗終止反應(yīng)，水性封片劑封片。陰性對(duì)照：反應(yīng)液中不加入NADPH-d。陽(yáng)性對(duì)照：已知陽(yáng)性組織（結(jié)腸造瘺切除標(biāo)本）同時(shí)進(jìn)行染色。

1.4 冰凍切片HE染色方法 冰凍切片切好后，室溫下干燥。4%多聚甲醛固定5 min，蒸餾水洗2 min，蘇木素染（37 ℃）1 min，自來(lái)水沖洗5 min，95%乙醇5 s，伊紅染液20～30 s，70%乙醇洗2次，95%酒精30 s，100%酒精30 s，95%酒精2道每次30 s，100%酒精2道每次30 s，100%二甲苯2道，第一道10 min，第二道5 min，中性樹膠封片后鏡下觀察。

1.5 雙重染色 NADPH-d的快速組織學(xué)染色完成后，自來(lái)水沖洗5 min，采集圖像后再行冰凍切片HE染色，完成后相同條件下再次采集圖像，存檔后觀察比較。

1.6 觀察指標(biāo) 光鏡下觀察：①擴(kuò)張段肌間神經(jīng)叢著色情況，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞是否可輕易識(shí)別，與背景有無(wú)強(qiáng)烈反差。②移行段結(jié)果：神經(jīng)叢、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞在數(shù)量、大小、分布范圍與擴(kuò)張段相比如何。③狹窄段有無(wú)陽(yáng)性神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分布，背景著色情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 全部數(shù)據(jù)采用SPSS for windows 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩種不同處理組間比較采用配對(duì)x2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 擴(kuò)張段 擴(kuò)張段經(jīng)冰凍切片HE染色后，30 min內(nèi)出結(jié)果，鏡下肌間神經(jīng)叢、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞隱約可見(jiàn)，背景組織細(xì)胞極多，故反差不大，若無(wú)豐富的經(jīng)驗(yàn)積累，即使病理科醫(yī)師也較難在短時(shí)間內(nèi)分辨出神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，準(zhǔn)確判斷術(shù)中結(jié)腸切緣是否已達(dá)正常腸段（見(jiàn)圖1）。與此相反的是NADPH-d的快速組織學(xué)染色，滴加反應(yīng)液后10 min內(nèi)出結(jié)果，背景清晰；低倍鏡下可見(jiàn)環(huán)肌和縱肌之間豐富的神經(jīng)叢呈串珠狀分布（見(jiàn)圖2），高倍鏡下可見(jiàn)大量神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，其胞漿著紫色，胞核空白無(wú)著色（見(jiàn)圖3）為判斷神經(jīng)叢所處位置及與冰凍切片HE染色結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，故對(duì)原先NADPH-d處理的切片采集圖像后再進(jìn)行快速HE染色，結(jié)果證實(shí)原先串珠狀分布的紫色組織，即為肌間神經(jīng)叢（見(jiàn)圖4）；高倍鏡下可清楚分辨核大、深染、胞質(zhì)略呈嗜堿性的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（見(jiàn)圖5）。

圖1 冰凍切片HE染色顯示肌間神經(jīng)叢（×400）

圖2 擴(kuò)張段NADPH-d的快速組織學(xué)染色（×100）

圖3 擴(kuò)張段肌間神經(jīng)叢及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（×400）

圖4 雙重染色后擴(kuò)張段肌間神經(jīng)叢及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（×100）

圖5 雙重染色后擴(kuò)張段肌間神經(jīng)叢及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（×400）

圖6 移行段NADPH-d的快速組織學(xué)染色，見(jiàn)神經(jīng)叢分布稀疏（×100）

圖7 移行段雙重染色，見(jiàn)神經(jīng)叢分布稀疏（×100）

2.2 移行段 低倍鏡下可見(jiàn)少數(shù)著色神經(jīng)叢，神經(jīng)叢之間距離較大，分布較擴(kuò)張段明顯稀疏（見(jiàn)圖6），高倍鏡下神經(jīng)節(jié)細(xì)胞可清楚分辨，但每個(gè)神經(jīng)叢內(nèi)節(jié)細(xì)胞數(shù)量及大小遠(yuǎn)不如擴(kuò)張段。移行段雙重染色后可證實(shí)沿肌間分布的神經(jīng)叢，與單用NADPH-d快速染色結(jié)果相符（見(jiàn)圖7）。

2.3 狹窄段 狹窄段NADPH-d的快速組織學(xué)染色，鏡下見(jiàn)背景清晰，無(wú)任何著色，未見(jiàn)神經(jīng)叢及陽(yáng)性神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（見(jiàn)圖8）?？焖貶E染色，可見(jiàn)肌間雜亂分布的肥大神經(jīng)纖維束，無(wú)任何陽(yáng)性神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（見(jiàn)圖9），背景組織細(xì)胞繁多，不易判斷結(jié)果。

圖8 狹窄段NADPH-d的快速組織學(xué)染色，未見(jiàn)陽(yáng)性神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（×100）

圖9 狹窄段快速HE染色，無(wú)陽(yáng)性神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（×100）

2.4 兩種方法診斷結(jié)果比較 快速NADPH-d法和HE法配對(duì)比較37例（見(jiàn)表1），結(jié)果NADPH-d法2例陰性，HE法有3例陰性，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩種方法陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表1 快速NADPH-d法和HE法結(jié)果比較（n=37）

3 討論

HD是一種兒童常見(jiàn)的消化道發(fā)育畸形，可以引起嬰兒腸梗阻和慢性便秘，在我國(guó)的發(fā)病率約為1:5000，為小兒外科最常見(jiàn)的先天性畸形之一。臨床上常見(jiàn)的診斷方法如鋇劑灌腸造影、肛門直腸測(cè)壓、直腸黏膜活檢術(shù)，很難準(zhǔn)確判斷病變的范圍，準(zhǔn)確性和敏感性很難達(dá)到臨床要求。即使手術(shù)前行直腸黏膜活檢術(shù)，依靠HE染色鏡檢，也只能從鏡下觀察神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的有無(wú)去判定巨結(jié)腸診斷是否成立，而無(wú)法確定病變腸管的范圍。一般而言，在手術(shù)中根據(jù)術(shù)者經(jīng)驗(yàn)及腸管的大體觀察去判斷病變段腸段范圍，如術(shù)中行快速冰凍切片HE染色，遇到不典型病例或病理科醫(yī)師經(jīng)驗(yàn)不足，明顯會(huì)影響腸管切除范圍的判定，導(dǎo)致手術(shù)效果不佳，部分患兒還有反復(fù)的便秘或大便失禁，需再次手術(shù)切除剩余部分病變腸管，嚴(yán)重影響患兒的生活質(zhì)量[1-2]。

目前研究較多的術(shù)中快速診斷方法有：冰凍切片HE染色法、AchE染色、LDH染色法，但都不甚理想。如前所述，HE染色法可以觀察腸壁有無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的存在，神經(jīng)纖維有無(wú)異常增生，如果全部切片都未見(jiàn)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，則可診斷為HD。但小兒的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)育是一個(gè)逐漸成熟的過(guò)程，尤其在新生兒時(shí)期，發(fā)育更是不成熟，故HE染色對(duì)于識(shí)別發(fā)育未成熟、結(jié)構(gòu)不典型的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞有一定難度，因此經(jīng)驗(yàn)在診斷上特別重要，直接影響診斷的準(zhǔn)確率。與此相反，NADPH-d的快速染色法對(duì)于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞具有高識(shí)別性，Montedonico等[3]認(rèn)為特別適合診斷新生兒期HD。另外HE染色流程中需固定、脫水等較多步驟，耗時(shí)長(zhǎng)。在HD病變段腸管中，AchE活性異常升高，通過(guò)AchE染色顯色反應(yīng)可看到膽堿能神經(jīng)纖維大量增生，過(guò)去該流程要花費(fèi)數(shù)小時(shí)，影響術(shù)中快速診斷的應(yīng)用。Kobayashi等[4]改進(jìn)了新方法，使染色時(shí)間縮短到6 min，使術(shù)中快速診斷成為可能。但AchE既存在于膽堿能神經(jīng)元也存在于非膽堿能神經(jīng)元，假陽(yáng)性率高，且在新生兒中易出現(xiàn)假陰性，所以目前較少單純用AchE染色來(lái)診斷HD。有報(bào)道稱HE法和AchE染色兩者結(jié)合可以更好診斷HD，但增加了大量操作步驟及時(shí)間[5]，不利于術(shù)中快速診斷。至于LDH染色法，因能在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中形成藍(lán)紫色顆粒狀沉淀物，有時(shí)候也能判斷出無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞腸段的范圍[6]，但這種酶對(duì)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及神經(jīng)纖維缺乏特異性，而且一般要聯(lián)合應(yīng)用AchE染色，故不建議用于巨結(jié)腸的診斷[5]。

本研究中擴(kuò)張段腸管經(jīng)NADPH-d的快速染色，可見(jiàn)環(huán)肌和縱肌之間豐富的神經(jīng)叢，呈串珠狀分布，高倍鏡下可見(jiàn)大量陽(yáng)性神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，背景無(wú)著色。與HE法配對(duì)比較HD 37例，結(jié)果NADPH-d法2例陰性，其中1例經(jīng)證實(shí)為全結(jié)腸型巨結(jié)腸。HE法有3例陰性，其中有2例再經(jīng)NADPH-d法檢測(cè)證實(shí)為陽(yáng)性，考慮腸神經(jīng)元發(fā)育不良，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞形態(tài)不典型，故無(wú)法識(shí)別；另外1例全結(jié)腸型巨結(jié)腸，因取材因素，無(wú)陽(yáng)性結(jié)果。

綜上所述，本研究建立了一種以NADPH-d酶組織化學(xué)方法為基礎(chǔ)的腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞快速染色方法，用于術(shù)中快速診斷先天性巨結(jié)腸，確定腸管切除范圍。經(jīng)過(guò)雙重染色證實(shí)，NADPH-d法顯示的陽(yáng)性神經(jīng)叢與神經(jīng)節(jié)細(xì)胞與HE法完全相符，且染色背景清晰，無(wú)干擾，說(shuō)明該方法切實(shí)可行。在前期實(shí)驗(yàn)中，課題組摸索了各種反應(yīng)條件、流程，發(fā)現(xiàn)該反應(yīng)液配置簡(jiǎn)單，易掌握，切片不需事先固定，也不同于其他染色方法，無(wú)需水化、脫水、染色等流程，避免接觸二甲苯等致癌物質(zhì)[7-8]，而僅需在37 ℃條件下滴加反應(yīng)液，10 min左右即出結(jié)果。該方法新穎，診斷快速，較冰凍切片HE染色法具有一定優(yōu)越性。但目前僅是一個(gè)初步研究結(jié)果，樣本均為典型HD病例，對(duì)于HD類緣病診斷結(jié)果如何，尚需進(jìn)一步研究。

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