劉云春 舒麗莎 于秀梅

卵巢癌是婦科腫瘤中病死率最高的惡性腫瘤，由于腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞的凋亡、抑癌基因的失活關(guān)系密切，F(xiàn)HIT和Bax基因在促進(jìn)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。本研究通過檢測卵巢腫瘤組織中FHIT和Bax蛋白的表達(dá)狀況，分析它們與上皮性卵巢癌臨床分期、病理類型、病理組織分級、淋巴轉(zhuǎn)移等臨床病理諸特征的關(guān)系，探討其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用和關(guān)系，了解其在卵巢癌預(yù)后方面的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科住院并經(jīng)手術(shù)治療的原發(fā)性的上皮性卵巢癌患者材料，選擇病歷資料完整者共50例，患者年齡21～76歲，平均年齡(54±12)歲，經(jīng)手術(shù)病理檢查確診，其中病理類型:卵巢漿液性癌30例，粘液性癌14例，子宮內(nèi)膜樣癌4例，透明細(xì)胞癌2例;病理分化程度:高分化 32例，中低分化 18例;手術(shù)病理分期［按國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)2000年手術(shù)病理分期標(biāo)準(zhǔn)］:Ⅰ期和Ⅱ期16例，Ⅲ期和Ⅳ期34例;盆腔淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移者16例，無轉(zhuǎn)移者34例。選擇同期卵巢良性卵巢腫瘤20例及卵巢交界性腫瘤15例作為參照。

1.2 免疫組化分析 采用免疫組織化學(xué)SP法，一抗為兔抗人FHIT蛋白多克隆抗體，鼠抗人Bax多克隆抗體，稀釋1∶50為工作濃度。SP試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)為北京中山生物技術(shù)公司產(chǎn)品。手術(shù)標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，3 μm厚連續(xù)切片，貼于涂有多聚賴氨酸的載玻片上。切片染色前常規(guī)脫蠟、水化，修復(fù)抗原，0.3%H2O2溶液阻斷內(nèi)源性的過氧化物酶，全部操作過程按SP試劑盒說明書操作規(guī)程完成。用已知的陽性切片作為陽性對照，用磷酸鹽(PBS)緩沖液代替一抗作為陰性參照。

1.3 染色特征及結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) FHIT和Bax的染色定位于腫瘤細(xì)胞漿中，以細(xì)胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒視為陽性細(xì)胞，參照Connlly等的方法，染色結(jié)果判定的標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)染色的強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)綜合評分:(1)染色強(qiáng)度:無著色是0分;淡黃色是1分;棕黃色為2分;棕褐色為3分;(2)陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù):＜10%為0分;10% ～50%為1分;50% ～75%為2分;＞75%為3分。FHIT和Bax最終的評定結(jié)果為染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的乘積，1～2分為陰性，3～9分為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)和確切概率法(Fisher’s exact test)，F(xiàn)HIT和Bax蛋白的相關(guān)性采用Speaman等級相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FHIT和Bax在卵巢上皮性腫瘤中的表達(dá) FHIT蛋白在良性組和交界性組中均陽性表達(dá)，癌癥組中的陽性率降低為72%，明顯低于良性組和交界性組(χ2=11.732，P ＜0.05);Bax主要表達(dá)在卵巢上皮(或癌細(xì)胞)的胞漿，間質(zhì)偶有表達(dá)。3組Bax的表達(dá)依次增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.066，P＞0.05)。見表1。

表1 不同組織中FHIT和Bax的表達(dá) 例

2.2 病理分期與FHIT和Bax的表達(dá) 卵巢癌組病理分期Ⅰ/Ⅱ期和Ⅲ/Ⅳ期FHIT陽性表達(dá)率分別為75%和70.58%，2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);卵巢癌組病理分期Ⅰ/Ⅱ期和Ⅲ/Ⅳ期Bax陽性表達(dá)率分別為43.75%和38.23%，2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

表2 病理分期與FHIT和Bax的表達(dá) 例

2.3 病理類型與FHIT和Bax的表達(dá) 3組FHIT、Bax陽性表達(dá)率接近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表3。

2.4 分化程度與FHIT和Bax的表達(dá) 在高分化、中低分化卵巢癌組織中FHIT陽性表達(dá)率分別為81.25%和55.55%，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)在高分化、中低分化卵巢癌組織中Bax陽性表達(dá)率分別為50.00%和22.22%，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見表4。

表3 病理類型與FHIT和Bax的表達(dá) 例

表4 分化程度與FHIT和Bax的表達(dá) 例

2.5 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與FHIT和Bax的表達(dá) 在淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移組和無轉(zhuǎn)移組的卵巢癌組織中FHIT陽性表達(dá)率分別為82.35%和50%，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移組和無轉(zhuǎn)移組的卵巢癌組織中Bax陽性表達(dá)率分別為38.23%和43.75%，2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見表5。

表5 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與FHIT和Bax的表達(dá) 例

2.6 卵巢癌組織中FHIT和Bax表達(dá)的相關(guān)性 50例卵巢癌組織中FHIT和Bax表達(dá)的關(guān)系，進(jìn)行spearman相關(guān)分析顯示，F(xiàn)HIT和Bax表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.400，P ＜0.01)。見表6。

表6 卵巢癌組織中FHIT和Bax相關(guān)性 例

3 討論

3.1 FHIT的表達(dá)與上皮性卵巢癌的關(guān)系 Buttitta等［1］對54例早期卵巢癌研究發(fā)現(xiàn)，4%(2/54)FHIT基因出現(xiàn)異常轉(zhuǎn)錄，15%(8/54)有等位基因的缺失，22%(12/54)有乳腺癌和(或)卵巢癌家族史的年輕患者，這些病例無FHIT基因的改變。結(jié)果表明，F(xiàn)HIT在卵巢癌的發(fā)生中起一定的作用。另一項(xiàng)卵巢癌研究發(fā)現(xiàn)，晚期癌中位于染色體3p14的FHIT位點(diǎn)的LOH頻率顯著增高，提示FHIT與晚期卵巢癌有關(guān)。Manderson等［2］報(bào)道一些上皮性卵巢癌標(biāo)本中3號染色體短臂(3p)有三個(gè)最小區(qū)域的缺失，提示FHIT基因的失活可能對卵巢癌的發(fā)生有重要作用。Mandai等［3］研究發(fā)現(xiàn)39%的卵巢癌和83%的交界性卵巢腫瘤標(biāo)本同時(shí)出現(xiàn)正常和異常的FHIT轉(zhuǎn)錄，8%(4/51)的卵巢癌標(biāo)本其FHIT轉(zhuǎn)錄缺失且均為Ⅲ～Ⅳ期的低分化晚期卵巢癌病例，而在良性卵巢腫瘤和正常卵巢組織中FHIT轉(zhuǎn)錄未見異常。Ozaki等［4］用免疫組化分析了44例卵巢癌、19例交界性癌和16例良性腺瘤的FHIT的表達(dá):14%(6/44)的卵巢癌標(biāo)本中FHIT蛋白表達(dá)降低或缺失，但在交界性和良性腫瘤中均蛋白表達(dá);蛋白表達(dá)的缺失與FHIT基因轉(zhuǎn)錄缺失密切相關(guān)，也都發(fā)生在晚期(Ⅲ～Ⅳ期)腺癌病例中。這些研究提示FHIT基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)異?？赡苁锹殉矏盒阅[瘤，特別是晚期腫瘤的一個(gè)重要標(biāo)志，F(xiàn)HIT表達(dá)缺失或降低是卵巢癌發(fā)生的重要遺傳學(xué)事件。

本試驗(yàn)主要研究FHIT在上皮性卵巢癌中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)28%的卵巢癌FHIT蛋白表達(dá)降低或缺失，表達(dá)較良性卵巢上皮性腫瘤和交界性卵巢上皮性腫瘤明顯降低(P＜0.05);但在良性上皮腫瘤和交界性卵巢上皮性腫瘤中的表達(dá)無明顯的差異(P＞0.05)。本試驗(yàn)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)FHIT的表達(dá)與病理分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切(P＜0.05)，F(xiàn)HIT蛋白的低表達(dá)主要見于低分化癌和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，提示FHIT與卵巢癌的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)，在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，其異常表達(dá)與卵巢癌的預(yù)后有關(guān)。

3.2 Bax的表達(dá)與上皮性卵巢癌的關(guān)系 Schuyer等［5］報(bào)道Bax表達(dá)與卵巢癌自然發(fā)展過程(相對危險(xiǎn)系數(shù)0.44，P=0.05)和總生存率(相對危險(xiǎn)系數(shù) 0.42，P=0.03)有聯(lián)系。Bax的表達(dá)可能成為卵巢癌患者的一個(gè)預(yù)測指標(biāo)。Shigemasa等［6］用半定量PCR技術(shù)測定Bax在卵巢腫瘤及腺癌中表達(dá)明顯高于卵巢正常組織(P＜0.05)。生存分析表明Bax mRNA的低表達(dá)與卵巢癌Ⅲ期患者的低生存密切相關(guān)(P=0.05)。Kupryjanczyk等［7］研究表明，Bax表達(dá)與 PR水平相關(guān)(P ＜0.0189)，而與ER無關(guān)，說明Bax蛋白調(diào)節(jié)有一定的組織特異性。Bax可隨卵巢黃體周期而改變，在月經(jīng)中期及妊娠早期無表達(dá)，而在退化黃體中有表達(dá)，提示Bax通過控制凋亡在人類黃體壽命中期重要作用。當(dāng)妊娠后，hCG可通過降低Bax的表達(dá)來延長黃體壽命。Skirnisdottir等［8］報(bào)道，Bax的陽性表達(dá)與年齡相關(guān)(P=0.012)，提示更好的生存率。多變量回歸分析表明，腫瘤分級(P=0.0006)和 Bax的表達(dá)(P=0.020)是獨(dú)立和有意義的預(yù)后指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn):從良性到惡性卵巢上皮性腫瘤Bax均有表達(dá)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。卵巢上皮性癌中Bax的陽性表達(dá)只與組織分化程度有關(guān)，Bax的陽性表達(dá)率與年齡、FIGO分期、病理類型、殘余灶大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移不相關(guān)(P＞0.05)。譚毅等［9］也發(fā)現(xiàn)卵巢上皮性腫瘤中有 Bax的表達(dá)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);Bax在不同組織分化的卵巢癌中的表達(dá)有顯著差異，組織分化越好，Bax的表達(dá)率越高。而譚毅等［9］報(bào)道，Bax在卵巢癌中的表達(dá)與病理分級成正比，與我們的結(jié)果不同。以上檢測結(jié)果的不同，可能是受樣本例數(shù)、檢測對象和實(shí)驗(yàn)方法的靈敏度等的影響，故可通過通過擴(kuò)大樣本和改進(jìn)方法等來進(jìn)一步研究。

3.3 上皮性卵巢癌中FHIT和Bax的相關(guān)性 在上皮性卵巢癌中FHIT和Bax的相關(guān)性鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)探討FHIT和Bax在皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的相互關(guān)系，發(fā)現(xiàn)FHIT和Bax的表達(dá)成正相關(guān)(r=0.400，P ＜0.01)。因?yàn)?FHIT、Bax 參與了細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)。所以FHIT和Bax在卵巢腫瘤形成和發(fā)展中是相輔相成的關(guān)系。

卵巢上皮性腫瘤的發(fā)生需要多個(gè)癌蛋白的參與，這些癌蛋白可誘導(dǎo)瘤細(xì)胞的增生、分化、轉(zhuǎn)移及腫瘤血管的形成。FHIT可能通過參與凋亡的調(diào)節(jié)，抑制卵巢上皮腫瘤的形成及惡性進(jìn)展。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)卵巢上皮性癌中的FHIT表達(dá)缺失高于卵巢良性或交界性腫瘤，而且卵巢上皮性癌中FHIT表達(dá)隨組織分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)還同時(shí)發(fā)現(xiàn)Bax也參與了卵巢上皮性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。所以FHIT和Bax在卵巢上皮性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要意義。

卵巢癌的化療是卵巢癌治療的重要手段，研究表明，許多化療藥物均能不同程度地誘導(dǎo)凋亡，腫瘤細(xì)胞凋亡敏感性可能是影響化療效果的關(guān)鍵因素［10］，因此，能否誘導(dǎo)凋亡已成為篩選抗癌藥物的標(biāo)準(zhǔn)之一，如何誘導(dǎo)凋亡也成為新的化療目標(biāo)。

癌基因的異常表達(dá)或抑癌基因的表達(dá)缺失導(dǎo)致腫瘤對傳統(tǒng)治療方案敏感性下降，由此帶來腫瘤的進(jìn)展和療效的下降。新的基因治療是通過基因傳遞恢復(fù)腫瘤細(xì)胞對傳統(tǒng)治療的反應(yīng)性。因此，促凋亡基因家族成員Bax可以成為腫瘤細(xì)胞傳統(tǒng)化療和放射治療的增敏劑。有研究表明，當(dāng)放療聯(lián)合Ad/Bax比單獨(dú)放療或Ad/Bax顯著增加了卵巢癌細(xì)胞的死亡，此外，與Bax調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡相一致的是放療聯(lián)合Ad/Bax可明顯的觀察到卵巢癌細(xì)胞的凋亡［11］。

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2 Manderson EN，Presneau N，Provencher D，et al.Comparative analysis of loss of heterozygosity of specific chromosome 3，13，17，and X loci and Tp53 mutations in human epithelial ovarian cancer.Mol Carcinog，2008，34:78-90.

3 Mandai M，Konishi I，Kuroda H，et al.Expression of abnormal ranscripts of the FHIT(fragile histidine triad)gene in ovarian carcinoma.Eur J Cancer，1998，34:745-749.

4 Ozaki K，Enomoto T，Yoshino K，et al.Impaire FHIT expression characterizes serous ovarian carcinoma.Br J Cancer，2001，85:247-254.

5 Schuyer M，Vander Burg MF，Henzen Logrnans SC，et al.Reduced expression of bax is associated with poor prognosis in patients with epithelial ovarian cancer:a multifactorial analysis of TP53，p21，Bax and Bcl-2.Br J Cancer，2001，85:1359-1367.

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7 Kupryjanczyk J，Dansonka Mieszkowska A，Szymanska T，et al.Spontaneous apoptosis in ovarian carcinoma:a positive association with p53 gene mutation is dependent on growth fraction.Br J Cancer，2000，82:579-583.

8 Skirnisdottir I，Sorbe B，Seidal T，et al.P53，bcl-2，and bax:their relations hip and effect on prognosis in early stage epithelial ovarian carcinoma.Int J Gynecol Cancer，2001，11:147-158.

9 譚毅，張曉化，將友義.抗凋亡基因bcl-2和bax與卵巢上皮性腫瘤的關(guān)系.現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展，1997，6:19-21.

10 Ckman JA.Apoptosis and chemotherapy resistance.Eur J Cancer，1996，32:921.

11 Arafat WO，Gomez-Navarro J，Xiang J，et al.An adenovirua encoding proapototic Bax induces apoptosis and enhances the radiation effect in human ovarian cancer.Molecular Therapy Res，2006，6:545-554.