蒙兆年

(寧夏師范學(xué)院醫(yī)學(xué)院 寧夏固原 756000)

本實驗利用自行配制的染液，通過具體實驗進(jìn)行整塊組織H.E染色制片。此法制成的切片染色效果較好，色彩更加均勻。

1 材料與方法

1.1 材料 本實驗所用切片石蠟、羊肝臟、載玻片、蓋玻片、醫(yī)用酒精、福爾馬林溶液、蘇木素液、伊紅染液、二甲苯、蒸餾水等。

1.2 主要實驗儀器 德國徠卡2016超薄切片機(jī)、YB－6型生物組織石蠟包埋機(jī)、DK－型電熱恒溫水槽、泰斯特電熱恒溫培養(yǎng)箱、45角式系列臺式低速離心機(jī)、YT－6C型生物組織攤烤片機(jī)、YTG－5E型生物組織處理多用機(jī)等儀器。

2 方法

2.1 染色液的配制 ①蘇木素染色液。配制成分:蘇木素染色劑15mg，蒸餾水40mL，鉀明礬600mg，碘酸鈉5mg，將4種藥品混合，每次染色現(xiàn)用現(xiàn)配。②新型伊紅配制染液。配制成分:伊紅R250mg，95%酒精50mL，蒸餾水50mL，冰醋酸少許。配制過程:現(xiàn)將250mg伊紅溶液溶于蒸餾水2mL中，溶解后將冰醋酸一滴一滴加入其中，在滴冰醋酸的過程中邊滴邊攪動，這時可見沉淀形成，接著再往液體中加入蒸餾水2mL。繼續(xù)等冰醋酸至沉淀不再增強為止。然后過濾將所沉淀的物質(zhì)置于50°～60°干燥箱中烤干，烤干后將沉淀物溶于50mL的95%酒精中即成。此法配制的伊紅染液也是邊用邊配，以保持所配液體的新鮮和成分的純度性。

2.2 操作步驟 ①固定:整塊組織進(jìn)行固定時可用BOUIN液或福爾馬林等進(jìn)行固定，固定的時間一般為36小時左右。因為整塊組織進(jìn)行染色時所取材組織塊大，因而固定的時間也要長。這樣就可充分保證固定液滲透到組織塊中，達(dá)到固定的目的，對成分進(jìn)行保護(hù)，更好地保證了制作切片的質(zhì)量。②浸洗:將固定后的組織塊按常規(guī)的方法放入蒸餾水中進(jìn)行浸洗。③染蘇木素液:將浸洗后的組織塊與染液按1:6的比例進(jìn)行浸洗染色。染色時間應(yīng)該考慮取材的組織塊的大小和氣溫高低。一般情況下整塊組織染色的時間較長，需要4小時左右。④浸洗分色:可用蒸餾水進(jìn)行浸洗。在浸洗的過程中每1～2小時可置換一次蒸餾水，直到不再有余色溢出為止。浸洗的時間一般要4小時左右，這時組織塊表面呈現(xiàn)紫紅色。⑤藍(lán)化:接著將組織塊放在容器中用自來水沖洗4小時左右，然后放置2小時，再更換一次自來水，再放置2小時。處理后的組織塊呈現(xiàn)藍(lán)色。⑥梯度濃度酒精脫水:將經(jīng)過上述步驟處理后的石蠟組織塊經(jīng)70%、80%、90%酒精進(jìn)行脫水。⑦伊紅染色:在自制的伊紅酒精染液中浸染約2小時左右，材料與染液的比例也按1:6的比例進(jìn)行染色。⑧鹽酸酒精進(jìn)行分色:將伊紅染色后的組織塊經(jīng)過95%酒精進(jìn)行分色大約1分鐘左右。⑨純酒精進(jìn)行脫水:將鹽酸酒精分色后的組織塊經(jīng)100%純酒精進(jìn)行脫水1小時左右。⑩二甲苯透明:將脫水后的石蠟組織經(jīng)二甲苯進(jìn)行透明，以便除去組織中的雜質(zhì)成分。○11石蠟組織包埋:將石蠟放進(jìn)裝有經(jīng)過上述途徑制作的石蠟組織塊中，進(jìn)行包埋?！?2切片:將包埋后的石蠟組織塊用超薄切片機(jī)將通過以上各種途徑制作的石蠟組織切片切成5～8μm厚的切片。后續(xù)其他制作程序與傳統(tǒng)石蠟組織切片制作程序無異。以上就是整塊組織H.E染色制作切片法的步驟。

3 實驗細(xì)節(jié)的改變

整塊組織H.E染色制片，有別于傳統(tǒng)石蠟切片單片片染制作法，從操作步驟上來說，主要從以下幾個方面進(jìn)行了改變。

3.1 染色時間的改變 傳統(tǒng)石蠟單片片染制作時蘇木精染色的時間是5～10分鐘左右;伊紅染色的時間是3～5分鐘左右;而整塊組織H.E染色時間制作者經(jīng)過多次實驗后，認(rèn)定為在蘇木精染液中需4小時為最佳;在伊紅染液中需2小時為最佳，因為如果染色時間太短的話，染液就不能很好地滲透到組織材料內(nèi)部，經(jīng)過以上時間段的染色后，效果就很好了。

3.2 氣溫對染色的影響 氣溫對染色的效果有一定的影響。染色時氣溫不合適，可能會導(dǎo)致制片所使用的染液出現(xiàn)變性、凝固、沉淀等現(xiàn)象。所以在整塊組織H.E染色制作切片的過程中，制作時周圍溫度太低或太高都不行，一般要使用的最佳溫度是25～30℃為最佳，如果周圍溫度達(dá)不到這個要求，制作者就應(yīng)該將所取材制作的組織材料放置在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，以便保持染色時的溫度恒定，從而達(dá)到最佳的染色效果。

3.3 酒精分色時間的調(diào)整 傳統(tǒng)石蠟組織單片片染制作時用鹽酸酒精分色一般在10秒左右。整塊組織H.E染色制片在使用鹽酸酒精分色時，因為所取材的組織塊比較大，分色時間用10秒左右，顯然是不行的，這時應(yīng)將時間相應(yīng)延長。一般使用95%酒精分色1分鐘為最佳，這樣做就可以讓內(nèi)部的組織更好地進(jìn)行分色。

3.4 蘇木精染色后蒸餾水浸洗程度的控制 因為浸洗程度達(dá)不到要求，細(xì)胞核就會呈現(xiàn)一團(tuán)紫藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)也會染上深藍(lán)色。這樣在制片的過程中就會惡性循環(huán)，影響伊紅的染色。制作者用蒸餾水進(jìn)行浸洗，每1～2小時換一次蒸餾水，這樣一直保持操作下去，到不再有余色溢出為止。蘇木精染色后浸洗的時間一般需4小時左右，這時組織塊呈現(xiàn)紫藍(lán)色，就會達(dá)到所制作的要求。

3.5 實驗關(guān)鍵程序的調(diào)整 石蠟組織整塊H.E染色切片制作法與傳統(tǒng)石蠟組織切片片染制作法的關(guān)鍵區(qū)別是對取材組織染色時間的調(diào)整，整塊組織H.E染色制作切片法是將所取材的組織染色時間改變在組織包埋切片之前進(jìn)行。當(dāng)組織切片后就不再染色，直至貼片至封固，從而成片。

4 討論

4.1 組織染色均勻，色彩更加鮮艷 只要制作者在制作的過程中，把握好染色時間，染色時就不會出現(xiàn)外深內(nèi)淺的染色現(xiàn)象。常用的酸性染料伊紅染色所顯示出來的紅色和堿性染料蘇木素染色顯示的藍(lán)色從色澤對比上來說更加鮮艷，在顯微鏡下的觀察效果會更好。

圖1 整塊組織H.E染色制作切片法與傳統(tǒng)切片單片片染制作法的結(jié)構(gòu)染色效果對比圖(取材:羊肝臟)

由圖1不難看出，整塊組織H.E染色制作法制作出來的切片比傳統(tǒng)石蠟組織切片單片片染制作出來的切片染色效果更好，其組織染色更加均勻，色彩更加鮮艷，與傳統(tǒng)制作法相比，并無明顯的組織結(jié)構(gòu)差異。制作者在染色時一定要把握好染色的時間，染色時間過長或過短都會導(dǎo)致染色效果不佳。蘇木精染色的時間一般是4小時，伊紅染色的時間一般是2小時。而且進(jìn)行整塊組織染色過程中常用的將堿性染料蘇木素染色顯示的藍(lán)色和用酸性染料將伊紅顯示的紅色二者相比色澤更加鮮艷，在顯微鏡下的觀察效果會更好。

4.2 節(jié)省制作者的時間及精力 整塊組織H.E染色制作時可同時浸染數(shù)個不同器官系統(tǒng)的組織塊，為制作者節(jié)省大量的時間及精力，是制作大量生物醫(yī)學(xué)教學(xué)切片的首選方法。制作出來的教學(xué)切片成功效率高。無論制作切片時所取材的組織材料是動物亦或是人體的器官組織，由于各自具體組成成分及結(jié)構(gòu)特點的不同，用石蠟組織切片后的H.E染色，如皮膚，就比較難掌握脫水、透明及浸蠟的時間，難以在制作時切成連續(xù)的切片，初學(xué)者難以掌握。用整塊組織H.E染色法制作切片，則大多能獲得滿意的連續(xù)石蠟切片，一批次可制作一百張，比單片片染制作法效率要高，適宜于大批量切片制作需求。

4.3 可對染色進(jìn)行彌補 整塊組織H.E染色制作切片時，染色不理想時，可進(jìn)行彌補。如染色較淺，可分別進(jìn)行蘇木精及伊紅重復(fù)染色，如果染色過深，蘇木精染色如果過深時，可在95%酒精中進(jìn)行脫色，以對蘇木精進(jìn)行脫色;伊紅染色如果過深時，可在70%酒精中進(jìn)行脫色，以對伊紅進(jìn)行脫色。染色效果直至制作者滿意為止。

綜上，本實驗利用自行配制的染液進(jìn)行整塊組織H.E染色制作切片，具有許多的優(yōu)點，適用于大批量教學(xué)切片制作需求。本方法切實可行。值得推廣應(yīng)用。

［1］黃亞鳳.石蠟切片HE染色體會［J］.內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2004，19(4):436