于家文，郭美華，趙春暉，馮 斌

(1. 大連醫(yī)科大學(xué) 生物技術(shù)系, 遼寧 大連 116044; 2. 遼寧師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 遼寧 大連 116081)

包括多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)在內(nèi)的腦腫瘤治療目前仍是一個(gè)挑戰(zhàn)。血腦屏障(BBB)的存在限制了化療藥物到達(dá)腫瘤細(xì)胞。目前的主要方法是通過外科手術(shù)切除大部分腫塊及對(duì)浸潤部分的輔助治療。由于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的浸潤性生長，使它和正常腦組織沒有明顯界限。如何找到手術(shù)無法切除的殘存膠質(zhì)瘤細(xì)胞，是實(shí)現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療中有效預(yù)后的新課題和焦點(diǎn)。腫瘤細(xì)胞表面的特殊分子標(biāo)記為完成這一目標(biāo)提供了有效手段。表面結(jié)合葉酸[1]、轉(zhuǎn)鐵蛋白[2]、表面生長因子受體(EGFR)的抗體[3]的免疫脂質(zhì)體已經(jīng)應(yīng)用于含硼化合物BSH和其他治療藥物靶向?qū)肽z質(zhì)瘤細(xì)胞的研究中，并取得了較好的動(dòng)物體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

腫瘤靶向肽是一類能與腫瘤細(xì)胞表面特異受體結(jié)合的寡肽。與抗體及其他靶向分子相比，腫瘤靶向肽具有分子量更小、組織穿透能力更強(qiáng)、低免疫原性和高親和力、容易大量合成等優(yōu)點(diǎn)，在藥物靶向?qū)胂到y(tǒng)(drug delivery system, DDS)中具有廣闊的應(yīng)用前景[4-5]。GL1是一段通過噬菌體展示技術(shù)篩選出來的12短肽(LLADTTHHRPWT)。對(duì)高表達(dá)EGFR的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞ΔGli 36具有高親和性，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明GL1能夠有效地靶向腫瘤細(xì)胞[6]。本研究擬通過構(gòu)建GL1與EGFP的融合蛋白，重組成為具有靶向作用和帶有熒光示蹤功能的蛋白，為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的靶向治療提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

LA Taq DNA聚合酶、T4DNA連接酶、pMD18-T、DNA凝膠回收試劑盒、限制性核酸內(nèi)切酶Nde I和EcoR I購于寶生物大連有限公司。KOD DNA聚合酶購自東洋紡(上海)生物科技有限公司。Ni2+-樹脂填料購自Novagen公司, Anti-His 鼠單克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP) 標(biāo)記的二抗購自Invitrogen公司。ECL發(fā)光檢測(cè)試劑盒購自Thermo公司。U87△EGFR細(xì)胞由日本岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部松井秀樹教授惠贈(zèng)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方 法

1.2.1 PCR目的片段的擴(kuò)增：設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，在5'端分別加入Nde I和EcoR I酶切位點(diǎn)，以pEGFP-N1質(zhì)粒為模板，對(duì)GL1-EGFP和EGFP基因進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增GL1-EGFP的引物為： 5'-CCGCATATGCTTTTAGCTGATACAACGCACCGACCCTG-GACTGGAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3'；5'-CCGGAATTCGGCTTGTACAGCTCGTCCATG-3'。擴(kuò)增EGFP的引物為：5'-CCGCATATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3'；5'-CCGGAATTCGGCTTGTACAGCTCGTCCATG-3'。PCR反應(yīng)條件為：94℃ 預(yù)變性2 min；94℃ 變性 1 min，65℃退火1 min，72延伸1 min，循環(huán)30次，72℃延伸7 min。

1.2.2 克隆載體的構(gòu)建：1%瓊脂糖凝膠鑒定并回收PCR產(chǎn)物。平末端PCR產(chǎn)物3'末端加A反應(yīng)為：PCR純化產(chǎn)物6 μL，10×LA Taq buffer 1 μL，dNTP(10 mmol/L)2 μL，LA Taq DNA聚合酶1 μL，反應(yīng)總體系10 μL，72℃ 30 min進(jìn)行加A反應(yīng)。加A產(chǎn)物與pMD18-T載體連接過夜后轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌JM109中，在含有氨芐青霉素50 mg/L的LB固體平板上培養(yǎng)12～16 h進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取白色菌落，活化后提取質(zhì)粒并用Nde I和EcoR I進(jìn)行酶切鑒定。重組質(zhì)粒由生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序。

1.2.3 表達(dá)載體的構(gòu)建：測(cè)序后的重組質(zhì)粒酶切后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，回收插入的目的條帶，與Nde I和EcoR I酶切的pET-22b(+)表達(dá)載體連接后轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行蛋白表達(dá)。

1.2.4 目的蛋白的提取純化與Western blotting檢測(cè)：含有融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的工程菌在37℃培養(yǎng)過夜，菌液稀釋后繼續(xù)培養(yǎng)至OD600≈0.6，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，6 h后收集菌體超聲破碎。上清進(jìn)行 12% SDS-PAGE蛋白電泳，考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)目的蛋白表達(dá)情況。N端帶有His的融合蛋白利用組氨酸親和層析柱(His·Bind Column)進(jìn)行純化。純化后的蛋白電泳后采用半干式轉(zhuǎn)膜方式轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，利用anti-His抗體進(jìn)行Western blotting檢測(cè)。

以抗His-tag的鼠單克隆抗體為一抗，室溫孵育1 h，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠的抗體。 孵育1 h后利用ECL發(fā)光試劑盒進(jìn)行暗室曝光檢測(cè)。

1.2.5 U87△EGFR的細(xì)胞培養(yǎng)及共聚焦顯微觀察：細(xì)胞培養(yǎng)基為DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone)，含10%小牛血清(Hyclone), 1%硫酸鏈霉素和青霉素，培養(yǎng)條件為37℃，5% CO2。將細(xì)胞爬片浸入濃硫酸中過夜，75%乙醇浸泡6 h，三蒸水泡3 h，高壓滅菌后85℃烘干。烘干后的爬片表面用多聚賴氨酸處理后放入12孔板中，向每個(gè)孔加入1×105的U87△EGFR細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后再加入GL1-EGFP和EGFP至終濃度2 μmol/L，培養(yǎng)30 min后，室溫下用PBS清洗3次，每次5 min，4%多聚甲醛(PFA)固定10 min，PBS清洗3次后共聚焦顯微鏡觀察，拍照。

2 結(jié) 果

2.1 PCR目的產(chǎn)物的擴(kuò)增

通過PCR反應(yīng)，成功地?cái)U(kuò)增出了EGFP和GL1-EGFP目的基因，其中EGFP和GL1-EGFP的序列大小分別為737 bp和776 bp(圖1 泳道1和2)。

圖1 EGFP和GL1-EGFP的PCR擴(kuò)增和克隆重組質(zhì)粒的酶切結(jié)果

Fig 1 PCR of EGFP and GL1-EGFP and enzyme digestion of cloning recombinant plasmids

M: DL 2000 DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn); 1: EGFP的PCR擴(kuò)增; 2: GL1-EGFP的PCR擴(kuò)增; 3、4: EGFP 克隆重組質(zhì)粒的Nde I和 EcoRI雙酶切結(jié)果; 5、6: GL1-EGFP克隆重組質(zhì)粒的Nde I和 EcoRI雙酶切結(jié)果

2.2 克隆載體和表達(dá)載體的構(gòu)建

PCR產(chǎn)物連接到T載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選白斑進(jìn)行質(zhì)粒提取，Nde I 和 EcoRI雙酶切后電泳分析表明： EGFP和GL1-EGFP成功連接到T克隆載體上(圖1泳道3和4)，測(cè)序結(jié)果顯示EGFP和GL1-EGFP目的基因均無突變。

回收Nde I和EcoR I酶切后的GL1-EGFP和EGFP目的片段，與經(jīng)過同樣酶切的pET-22b(+)載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后挑選重組質(zhì)粒酶切鑒定，表明GL1-EGFP和EGFP插入到表達(dá)載體中(圖 2)。

2.3 蛋白的提取純化及Western blotting檢測(cè)

含有GL1-EGFP和EGFP表達(dá)載體的工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后提取蛋白， SDS-PAGE電泳表明：經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的總蛋白中，在29 kD和27 kD可以見到明顯的GL1-EGFP和EGFP表達(dá)條帶(圖3 泳道2和5)，而沒加IPTG誘導(dǎo)的總蛋白中未見相應(yīng)的條帶(圖3泳道3和6)。GL1-EGFP和EGFP的分子量與軟件預(yù)測(cè)的相同。利用鎳親和層析柱純化后獲得了高濃度的純化GL1-EGFP和EGFP蛋白(圖3 泳道1和4)。

圖2 EGFP和GL1-EGFP的表達(dá)重組質(zhì)粒的酶切結(jié)果Fig 2 Enzyme digestion of expression recombinant plasmids

M: DL 5000 DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn); 1: EGFP 表達(dá)重組質(zhì)粒的Nde I和 EcoRI雙酶切結(jié)果; 2: GL1-EGFP表達(dá)重組質(zhì)粒的Nde I和 EcoRI雙酶切結(jié)果

圖3 GL1-EGFP和EGFP表達(dá)和純化的SDS-PAGE結(jié)果

Fig 3 SDS-PAGE analysis of expression and purification of GL1-EGFP and EGFP

M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn); 1: 純化的GL1-EGFP; 2: IPTG誘導(dǎo)GL1-EGFP表達(dá) 3：無IPTG誘導(dǎo)GL1-EGFP表達(dá) (對(duì)照); 4: 純化的EGFP; 5: IPTG誘導(dǎo)EGFP表達(dá); 6: 無IPTG誘導(dǎo)EGFP表達(dá)(對(duì)照)

Western blotting 檢測(cè)結(jié)果顯示，在29 kD和27 kD的相應(yīng)條帶上，能夠看到相應(yīng)的雜交信號(hào)，證明純化蛋白為帶有組氨酸標(biāo)簽的GL1-EGFP和EGFP(圖 4)。

圖4 GL1-EGFP和EGFP 的Western blotting檢測(cè)

Fig 4 Western blotting analysis of purified GL1-EGFP and EGFP

2.4 GL1-EGFP的體外細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87△EGFR分別與GL1-EGFP和EGFP孵育培養(yǎng)30 min后進(jìn)行共聚焦顯微鏡觀察。GL1-EGFP作用的U87△EGFR細(xì)胞表面有很強(qiáng)的綠色熒光(圖5 A)，而對(duì)照組EGFP作用的U87△EGFR細(xì)胞表面看不到熒光(圖5 B)。

圖5 GL1-EGFP對(duì)U87△EGFR靶向作用的共聚焦顯微鏡結(jié)果Fig 5 Confocal microscopy analysis of GL1-EGFP binding with U87△EGFR cells in vitroA: EGFP (對(duì)照); B: GL1-EGFP

3 討 論

惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤目前仍是致死性的腦腫瘤疾病。近年來的藥物靶向傳輸為治療提供了一條可行途徑。但是腦血屏障的存在和腫瘤細(xì)胞的浸潤生長特性限制了藥物有效地到達(dá)腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而影響藥效，因此利用對(duì)腦瘤細(xì)胞具有靶向性的小分子多肽來攜帶藥物定向運(yùn)輸?shù)侥X腫瘤細(xì)胞具有廣闊的前景[7]。本研究所用的GL1靶向肽序列是通過噬菌體展示技術(shù)針對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞Gli36分離出來的，研究表明其對(duì)其他一些神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，如SNB19、U343MG、SF767和U373MG也具有一定的靶向作用[6]。十二肽的GL1(LLADTTHHRPWT)是相對(duì)疏水的，尤其在N端的亮氨酸leucine(L)，C端的脯氨酸(P)和色氨酸(W)，這樣GL1有可能通過疏水部分錨定腫瘤細(xì)胞的跨膜域。Hopp等[8]認(rèn)為，蛋白的抗原性一般與特殊氨基酸的親水性有關(guān)。GL1的親水指數(shù)是-0.3，說明這個(gè)肽具有略微疏水特性，不會(huì)引起抗原反應(yīng)。GL1與EGFP融合后，位于EGFP的N端，GL1-EGFP融合蛋白仍然能夠有效地表達(dá)并發(fā)出綠色熒光，說明沒有影響EGFP的有效折疊和正確構(gòu)象。

在構(gòu)建克隆質(zhì)粒的過程中，本研究發(fā)現(xiàn)，重組T載體轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌XLI-blue中的時(shí)候，攜帶GL1-EGFP的克隆質(zhì)粒的菌體高效的表達(dá)了所需要的目的蛋白，而這種情況在感受態(tài)大腸桿菌JM109中卻沒有發(fā)生。測(cè)序分析表明：GL1-EGFP插入LacZ基因內(nèi)部，沒有打斷原有β-半乳糖苷酶基因α-肽的讀碼框，并實(shí)現(xiàn)了順碼通讀，在lac啟動(dòng)子的作用下進(jìn)行了高效的表達(dá)，表達(dá)的GL1-EGFP的N端和C端各帶有β-半乳糖苷酶α-多肽的片段。

GL1-EGFP與神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)說明GL1能夠在30 min時(shí)間內(nèi)就錨定到腫瘤細(xì)胞表面，而沒有GL1的EGFP對(duì)細(xì)胞沒有結(jié)合作用，直觀的證明了GL1對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的靶向作用，為下一步改造GL1應(yīng)用于腦腫瘤的靶向治療提供依據(jù)。GL1對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞只具有錨定靶向作用，在細(xì)胞內(nèi)部還沒有觀察到EGFP的綠色熒光。研究表明：細(xì)胞穿膜肽(cell-penetrating peptides, CPPs)能夠?qū)⑸锎蠓肿訉?dǎo)入細(xì)胞內(nèi)部，常用的CPPs有人類免疫缺陷病毒(HIV)的TAT 的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(protein transduction domain, PTD)和聚賴氨酸[9-10]。GL1如果應(yīng)用于藥物傳輸系統(tǒng)需要將蛋白或者載荷導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)部，因此對(duì)GL1進(jìn)行改造

將蛋白或載荷導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部是下一步的研究?jī)?nèi)容。此外，由于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的異質(zhì)性，找到GL1的腫瘤細(xì)胞表面作用蛋白和位點(diǎn)也是具有挑戰(zhàn)性的工作，這將為腦腫瘤藥物的有效靶向運(yùn)輸和治療提供依據(jù)。

[1] Pan XQ, Wang H, Lee RJ. Boron delivery to a murine lung carcinoma using folate receptor-targeted liposomes [J]. Anticancer Res, 2002, 22(3):1629-1633.

[2] Maruyama K, Ishida O, Kasaoka S, et al. Intracellular targeting of sodium mercaptoundecahydrododecaborate (BSH) to solid tumors by transferrin-PEG liposomes, for boron neutron-capture therapy (BNCT) [J]. J Control Release 2004, 98(2):195-207.

[3] Feng B, Tomizawa K, Michiue H, et al. Delivery of sodium borocaptate to glioma cells using immunoliposome conjugated with anti-EGFR antibodies by ZZ-His [J]. Biomaterials, 2009, 30(9):1746-1755.

[4] Del Vecchio CA, Li G, Wong AJ.Targeting EGF receptor variant III: tumor-specific peptide vaccination for malig-nant gliomas[J]. Expert Rev Vaccines,2012, 11(2):133-144.

[5] Chunxiao Wu, Seong Loong Lo, Jerome Boulaire, et al. A peptide-based carrier for intracellular delivery of proteins into malignant glial cells in vitro[J]. J Control Release, 2008, 130(2): 140-145.

[6] Ho IA, Hui KM, Lam PY. Isolation of peptide ligands that interact specifically with human glioma cells [J]. Peptides, 2010, 31(4):644-650.

[7] Bidros DS, Vogelbaum MA. Novel drug delivery strategies in neuro-oncology [J]. Neurotherapeutics, 2009, 6(3):539-546.

[8] Hopp TP,Woods KR. Prediction of protein antigenic determinants from amino acid sequences [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1981, 78(6):3824-3828.

[9] Snyder EL, Dowdy SF. Recent advances in the use of protein transduction domains for the delivery of peptides, proteins and nucleic acids in vivo[J]. Expert Opin Drug Deliv, 2005, 2(1):43-51.

[10] Hitsuda T, Michiue H, Kitamatsu M. A protein transduction method using oligo-arginine (3R) for the delivery of transcription factors into cell nuclei [J]. Biomaterials, 2012, 33(18):4665-4672.