趙寶霞，田麗敏，竇 薇，呂海辰，李 梅，呂 申

(1. 大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 實(shí)驗(yàn)中心，遼寧 大連 116027； 2. 大連醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院， 遼寧 大連 116044； 3. 復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué)(8年制)，上海 200032)

肺癌的發(fā)病率和死亡率均居各種癌癥之首。非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC)占肺癌的80%以上，目前手術(shù)切除是對(duì)其治療最有效的方法。然而，多數(shù)患者在腫瘤發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于臨床晚期，失去了手術(shù)時(shí)機(jī)，另外即使接受了外科治療的患者也常需要化療輔助。因此，化療仍是目前臨床治療NSCLC應(yīng)用最廣的手段。然而，傳統(tǒng)化療藥物因其特異性差、毒副作用大在臨床應(yīng)用中受到很大的限制。近年來(lái)，以表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)為靶點(diǎn)的腫瘤分子靶向治療在晚期NSCLC應(yīng)用中療效顯著，其中應(yīng)用最廣的藥物是gefitinib和erlotinib。研究表明對(duì)EGFR-TKI敏感的NSCLC常有EGFR18、19、21位外顯子突變，而這些突變多見(jiàn)于亞裔、女性、非吸煙患者的腺癌。值得注意的是，隨著EGFR-TKI臨床應(yīng)用的拓展和時(shí)間的推延，一些原本對(duì)該藥敏感的NSCLC會(huì)產(chǎn)生獲得性耐藥，而獲得性耐藥是用該藥治療失敗的主要原因。探討NSCLC中 EGFR-TKI獲得性耐藥的發(fā)生機(jī)制已成為該藥臨床應(yīng)用中亟待解決的問(wèn)題。

文獻(xiàn)報(bào)道，有EGFR突變的NSCLC常會(huì)高表達(dá)EGFR和E-cadherin，多數(shù)高表達(dá)EGFR和E-cadherin的NSCLC對(duì)EGFR-TKI敏感[1-2]。那么，當(dāng)NSCLC患者對(duì)EGFR-TKI產(chǎn)生耐藥性時(shí)其攜帶的腫瘤是否會(huì)有EGFR和E-cadherin蛋白表達(dá)的變化？本研究采用逐步遞增藥物濃度、間歇作用體外誘導(dǎo)法誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞株NCI-H1975，建立了gefitinib獲得性耐藥細(xì)胞株——人肺癌細(xì)胞株NCI-H1975/GR，比較獲得性耐藥細(xì)胞株與親本株細(xì)胞的EGFR及E-cadherin蛋白表達(dá)變化，希望能為探討NSCLC的EGFR-TKI獲得性耐藥產(chǎn)生機(jī)制提供數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

細(xì)胞株：人肺腺癌細(xì)胞株NCI-H1975，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所，國(guó)家中醫(yī)藥管理局大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

主要試劑：gefitinib(Selleck公司，美國(guó))、鼠抗人 EGFR單克隆抗體(克隆號(hào)111.6， NeoMarkers，美國(guó))及鼠抗人E-cadherin單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)公司，中國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人肺癌細(xì)胞株NCI-H1975的培養(yǎng)：用RPMI-1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)，在37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)細(xì)胞株NCI-H1975，每隔3～4 d消化、傳代1次。培養(yǎng)細(xì)胞呈單層貼壁生長(zhǎng)。

1.2.2 Gefitinib獲得性耐藥細(xì)胞株NCI-H1975/GR的建立：采用逐步遞增gefitinib濃度、間歇作用體外誘導(dǎo)法誘導(dǎo)NCI-H1975細(xì)胞耐藥。Gefitinib以起始濃度12 μmol/L作用于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，24 h后棄去含藥培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，待其恢復(fù)正常生長(zhǎng)，消化傳代后復(fù)用相同濃度的gefitinib作用24 h，如此每一濃度反復(fù)兩次，藥物濃度遞增，反復(fù)換液傳代，歷時(shí)6個(gè)月獲得了能夠在含gefitinib濃度80 μmol/L培養(yǎng)基中良好生長(zhǎng)的耐藥細(xì)胞株(命名為NCI-H1975/gefitinib resistance，簡(jiǎn)寫(xiě)為NCI-H1975/GR)。

1.2.3 形態(tài)學(xué)觀察：倒置顯微鏡下直接觀察存活狀態(tài)的NCI-H1975與NCI-H1975/GR的細(xì)胞形態(tài)，特別是加入gefitinib后二者的細(xì)胞狀態(tài)變化。

1.2.4 生長(zhǎng)曲線測(cè)定：將濃度為1×104/mL 的NCI-H1975和NCI-H1975/GR的細(xì)胞懸液接種于24孔板中，每孔1.5 mL。每24 h計(jì)數(shù)其中3孔的細(xì)胞數(shù)，取平均值，連續(xù)7 d。以時(shí)間天數(shù)為橫坐標(biāo)，以每天的細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。 按照公式 T=tlg2/lgNt-lgN0計(jì)算細(xì)胞的倍增時(shí)間(其中T為群體倍增時(shí)間，t為連續(xù)培養(yǎng)時(shí)間，Nt為終末細(xì)胞數(shù)，N0為初始細(xì)胞數(shù)，單位為小時(shí))。

1.2.5 NCI-H1975及NCI-H1975/GR細(xì)胞的EGFR及E-cadherin蛋白表達(dá)檢測(cè)：細(xì)胞爬片生長(zhǎng)后，用冷丙酮固定細(xì)胞15 min，采用SP法進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，DAB法顯色，蘇木素復(fù)染，封片。用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.2.6 判斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)EGFR蛋白表達(dá)的判斷標(biāo)準(zhǔn)：以細(xì)胞膜或細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽(yáng)性表達(dá)，分別記錄表達(dá)部位，其表達(dá)強(qiáng)弱與親本細(xì)胞株的相應(yīng)表達(dá)部位比較。(2)E-cadherin蛋白表達(dá)的判斷標(biāo)準(zhǔn)：以細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)，其表達(dá)強(qiáng)弱與親本細(xì)胞的細(xì)胞膜表達(dá)比較。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 形態(tài)學(xué)變化

光鏡下NCI-H1975細(xì)胞呈上皮樣單層排列生長(zhǎng)，細(xì)胞大小不一，長(zhǎng)梭形，細(xì)胞邊界清楚，核大，圓形或橢圓形(圖1A)；gefitinib加入24 h后，細(xì)胞邊界不清，有的變成圓形，胞核內(nèi)可見(jiàn)粗顆粒(圖1B)，撤藥后1周左右細(xì)胞基本恢復(fù)到未加gefitinib前生長(zhǎng)狀態(tài)；gefitinib加入后與NCI-H1975細(xì)胞相比，NCI-H1975/GR細(xì)胞體積略小，多數(shù)為長(zhǎng)梭形，有的為圓形或紡錘形(圖1C)。

圖1 gefitinib誘導(dǎo)人肺腺癌NCI-H1975細(xì)胞耐藥過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)的變化(10×10)

2.2 生長(zhǎng)曲線

NCI-H1975和NCI-H1975/GR兩者的群體倍增時(shí)間分別為28.65 h和35.79 h，耐藥細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)間較親本細(xì)胞延長(zhǎng)7.14 h (P<0.05)。生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖2。

2.3 NCI-H1975及NCI-H1975/GR細(xì)胞的EGFR及E-cadherin蛋白表達(dá)

(1)EGFR蛋白的表達(dá)：該蛋白在NCI-H1975與NCI-H1975/GR細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿均呈陽(yáng)性表達(dá)，在兩細(xì)胞株細(xì)胞膜的表達(dá)強(qiáng)度相近，但在細(xì)胞漿的表達(dá)耐藥株NCI-H1975/GR明顯強(qiáng)于親本株NCI-H1975(圖3)。

(2)E-cadherin蛋白的表達(dá)：在NCI-H1975與NCI-H1975/GR細(xì)胞均呈陽(yáng)性表達(dá)，但二者的表達(dá)部位不同，在NCI-H1975細(xì)胞主要表達(dá)于細(xì)胞膜，而在NCI-H1975/GR細(xì)胞則主要表達(dá)于細(xì)胞漿，在細(xì)胞膜的表達(dá)明顯減弱(圖4)。

圖2 人肺癌NCI-H1975與NCI-H1975/GR細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

圖3 EGFR蛋白在人肺腺癌NCI-H1975與NCI-H1975/GR細(xì)胞中的表達(dá)(10×40)Fig 3 The protein expressions of EGFR in human lung adenocarcinoma cell lines NCI-H1975 and NCI-H1975/GR (10×40)A：NCI-H1975細(xì)胞；B：NCI-H1975/GR細(xì)胞

圖4 E-cadherin蛋白在人肺腺癌NCI-H1975與NCI-H1975/GR細(xì)胞中的表達(dá)(10×40)Fig 4 The protein expressions of E-cadherin in human lung adenocarcinoma cell lines NCI-H1975 and NCI-H1975/GR (10×40)A：NCI-H1975細(xì)胞；B：NCI-H1975/GR細(xì)胞

3 討 論

目前，EGFR-TKI的耐藥機(jī)制主要涉及以下幾個(gè)方面：(1)靶基因或靶蛋白的改變，如EGFR 20外顯子繼發(fā)突變，引起EGFR的構(gòu)象改變，使EGFR-TKI失去了作用靶點(diǎn)[3-4]；(2)癌基因的擴(kuò)增，如MET基因擴(kuò)增激活另一信號(hào)傳導(dǎo)途徑ErbB3-PI3K[5-6]；(3)下游信號(hào)分子的自身活化，如K-RAS和(或)B-RAF基因外顯子突變，引起信號(hào)傳導(dǎo)通路下游分子的自身活化或敏感性增強(qiáng)[7]；(4)癌組織通過(guò)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，失去上皮組織特性，使藥物失去作用靶點(diǎn)[8]。要研究這些機(jī)制，體外EGFR-TKI獲得性耐藥模型必不可少。在本研究中建立的EGFR-TKI獲得性耐藥細(xì)胞株NCI-H1975/GR能在含80 μmol/L的gefitinib培養(yǎng)基中良好生長(zhǎng)；與NCI-H1975相比藥物作用后的形態(tài)變化不一樣，群體倍增時(shí)間也明顯延長(zhǎng)，即生長(zhǎng)減慢。檢測(cè)結(jié)果表明NCI-H1975/GR細(xì)胞株已為gefitinib獲得性耐藥細(xì)胞株，可以用于該藥的耐藥機(jī)制研究。

EGFR是一種具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，是生長(zhǎng)因子受體家族成員之一，在結(jié)構(gòu)上包括3個(gè)主要功能區(qū)：胞外配體結(jié)合區(qū)、疏水跨膜區(qū)和胞質(zhì)酪氨酸激酶區(qū)。當(dāng)EGFR與它的配體如EGF結(jié)合后，促進(jìn)受體內(nèi)的酪氨酸激酶激活，導(dǎo)致受體酪氨酸殘基自身磷酸化，形成二聚體，從而激活信號(hào)傳導(dǎo)通路，引起細(xì)胞的增殖和分化[9-10]。EGFR主要表達(dá)于正常上皮細(xì)胞表面，在包括NSCLC在內(nèi)的一些上皮源性腫瘤細(xì)胞常過(guò)表達(dá)。作為EGRF-TKI的作用靶蛋白，EGFR表達(dá)水平常與EGFR-TKI的治療效果密切相關(guān)。在本研究中，該蛋白在NCI-H1975與NCI-H1975/GR細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿均呈陽(yáng)性表達(dá)，在兩細(xì)胞株細(xì)胞膜的表達(dá)強(qiáng)度相近，但在細(xì)胞漿的表達(dá)耐藥株NCI-H1975/GR強(qiáng)于親本株NCI-H1975。這提示gefitinib獲得性耐藥細(xì)胞的細(xì)胞漿有較多的EGFR蛋白表達(dá)。這可能是由于EGFR-TKI阻斷了EGFR的活化，信號(hào)不能傳導(dǎo)到其下游途徑，使細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢。此時(shí)，細(xì)胞需不斷合成EGFR蛋白以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，但由于細(xì)胞膜上原已存在EGFR，新合成的EGFR不能到達(dá)細(xì)胞膜行使功能，只能在細(xì)胞漿大量堆積。是否細(xì)胞漿EGFR表達(dá)增高可作為EGFR-TKI獲得性耐藥的標(biāo)志，有待在臨床研究中證實(shí)。

E-cadherin 是一類主要介導(dǎo)細(xì)胞之間相互粘附的鈣依賴性跨膜蛋白，主要表達(dá)在上皮細(xì)胞，廣泛參與細(xì)胞間的連接。E-cadherin正常表達(dá)對(duì)上皮細(xì)胞的分化起著重要作用；其異常表達(dá)被認(rèn)為與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生直接相關(guān)。據(jù)報(bào)道，用gefitinib誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞株A549或用erlotinib誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞HCC4006產(chǎn)生獲得性耐藥，耐藥細(xì)胞都發(fā)生了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，即E-cadherin表達(dá)的下降[11-12]。在本研究中， E-cadherin在NCI-H1975與NCI-H1975/GR細(xì)胞均呈陽(yáng)性表達(dá)，但二者的表達(dá)部位不同，在NCI-H1975細(xì)胞主要表達(dá)于細(xì)胞膜，而在NCI-H1975/GR細(xì)胞則主要表達(dá)于細(xì)胞漿，在細(xì)胞膜的表達(dá)明顯減弱。這提示在細(xì)胞發(fā)生gefitinib獲得性耐藥后E-cadherin在它的功能部位，細(xì)胞膜的表達(dá)降低，即此時(shí)這些細(xì)胞上皮分化減弱，失去部分上皮組織特性，但這些細(xì)胞是否、何時(shí)會(huì)出現(xiàn)間質(zhì)標(biāo)記蛋白的表達(dá)，即發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)化還需要進(jìn)一步研究。

總之，EGFR作為EGFR-TKI的靶蛋白，E-cadherin作為維持細(xì)胞上皮分化的蛋白均在NSCLC細(xì)胞中高表達(dá)，可作為NSCLC上皮分化的標(biāo)志蛋白。這兩種蛋白因功能的不同，在gefitinib獲得性耐藥產(chǎn)生過(guò)程中它們表達(dá)的變化也不同；在獲得性耐藥細(xì)胞株中，EGFR在細(xì)胞漿的表達(dá)明顯增高；E-cadherin在細(xì)胞膜的表達(dá)明顯降低。

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