亓 明，王新文，羅英偉，秦嶺峰，馬文鋒，張 強(qiáng)，辛世杰，段志泉

(1. 大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 血管外科, 遼寧 大連 116011；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 血管外科，遼寧 沈陽(yáng) 110011)

自體靜脈旁路移植術(shù)是臨床上治療動(dòng)脈阻塞性疾病的重要手段，常用于冠心病和動(dòng)脈硬化閉塞癥的血管重建。但由于內(nèi)膜增生(Intimal hyperplasia，IH)及后期的動(dòng)脈硬化所導(dǎo)致的移植段血管中遠(yuǎn)期狹窄和閉塞，影響了療效。現(xiàn)有資料證明，IH的發(fā)生為多種因素綜合作用的結(jié)果，其中血管平滑肌細(xì)胞(SMC)向內(nèi)膜遷移并過(guò)度增殖是其病變演變的重要環(huán)節(jié)[1]。而SMC的增殖，則有賴于細(xì)胞周期的進(jìn)入和進(jìn)行[2]。

細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動(dòng)的基本過(guò)程, 細(xì)胞在周期時(shí)相的變遷中進(jìn)入增殖、分化、衰老和死亡等生理狀態(tài)。細(xì)胞周期蛋白依賴激酶(Cyclin dependent kinase, CDK) 表達(dá)及活性的調(diào)控是細(xì)胞周期調(diào)控的核心,其中CDK2 和CDK4 主要作用于G1期和S期,具有啟動(dòng)DNA復(fù)制和誘發(fā)有絲分裂的雙重作用[3]。體外實(shí)驗(yàn)已顯示CDK2 、CDK4與細(xì)胞增殖之間有密切關(guān)系,其表達(dá)增加導(dǎo)致DNA 合成增加、進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖,而其水平下降或其抗體治療能夠抑制或減少細(xì)胞增殖[4]。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用RT-PCR方法和免疫組織化學(xué)方法研究細(xì)胞周期中G1/S期最具有代表性的CDK2、CDK4在移植血管不同時(shí)期的表達(dá)情況，探討其對(duì)自體移植靜脈SMC增殖和IH的作用,為自體移植靜脈再狹窄的防治提供一些依據(jù)和思路。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

CDK2、CDK4多克隆抗體，即用型SABC免疫組化染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；CDK2、CDK4、內(nèi)參照β-actin引物由上海生物工程公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)對(duì)象及分組

雄性Wistar大鼠(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)50只，2.5～3.0個(gè)月齡，體重250～300 g，參照隨機(jī)對(duì)照表隨機(jī)分為：1，2，3，7，14 d組，每組10只,各實(shí)驗(yàn)組大鼠正常頸靜脈為對(duì)照組。

1.3 動(dòng)物模型的建立及標(biāo)本制備

Wistar大鼠用10%水合氯醛(3 mL/100 g)經(jīng)腹腔麻醉后，在手術(shù)顯微鏡下切取0.5 cm長(zhǎng)頸內(nèi)靜脈間置移植于同側(cè)頸總動(dòng)脈，完成后移植段血管充盈，搏動(dòng)有力，示血管移植成功。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別于術(shù)后1、2、3、7及14 d麻醉狀態(tài)下處死取材。液氮快速冷凍后轉(zhuǎn)-70 ℃保存。

1.4 觀測(cè)指標(biāo)

(1)組織學(xué)觀察：切片行HE染色和Verhoeff-Van Gieson(VVG)染色，用計(jì)算機(jī)圖像分析儀觀察血管中段橫截面內(nèi)膜，每60度測(cè)量1次該處內(nèi)膜厚度，共6處，計(jì)算平均厚度。

(2)CDK2、CDK4免疫組化觀察：切片予微波抗原修復(fù)后，SABC法,DAB顯色，CDK2、CDK4定位于細(xì)胞核和細(xì)胞漿，陽(yáng)性細(xì)胞胞核與細(xì)胞漿染呈棕黃或黃色，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野(×400)，計(jì)數(shù)單位視野陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分率，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%為陰性，記為(-)；10%≦陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<50%為陽(yáng)性，記為(+)；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>50%為強(qiáng)陽(yáng)性，記為(++)。輔以計(jì)算機(jī)圖像分析儀結(jié)果。所有結(jié)果均由2人盲法單獨(dú)判定。

(3)應(yīng)用RT-PCR觀察CDK2,CDK4 mRNA表達(dá)：組織勻漿，苯酚/異硫氰酸胍法提取總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，CDK2 上游引物5′-AAGATCGGAGAGGGCACGTACGGAGTGGTG-3′，下游引物5′-AGGCTCTTGCTAGTCCAAAGTCTGCCAACT-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為430 bp；CDK4上游引物5′-GCTACCACTCGATATGAACCCGTGGCTGAA-3′，下游引物5′-GGTGCTTTGTCCAGGTATGTCCGTAGGTCC-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為320 bp；內(nèi)參照β-actin上游引物5′-GATTGCCTCAGGACATTTCTG-3′，下游引物5′-GATTGCTCAGGACATTTCTG-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為690 bp。以β-actin為內(nèi)對(duì)照進(jìn)行PCR擴(kuò)增(RT-PCR)，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳于凝膠自動(dòng)成像儀1D Kodak上自動(dòng)成像，應(yīng)用GelWorks 1D Advanced軟件進(jìn)行結(jié)果定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 移植靜脈內(nèi)膜平均厚度的變化

各組不同時(shí)期移植靜脈內(nèi)膜平均厚度情況見(jiàn)表1。移植后7 d，內(nèi)膜厚度與管壁厚度接近高峰，與對(duì)照組及移植后1、2、3 d比較，差異有顯著性意義(P<0.05)。

2.2 移植靜脈CDK2、CDK4陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率的變化

在正常細(xì)胞中僅有少量CDK2、CDK4陽(yáng)性表達(dá)，不超過(guò)5%，陽(yáng)性表達(dá)在光鏡下表現(xiàn)為棕黃色。移植后1 d陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)開(kāi)始增多。移植后2 d，陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯增加，至7 d時(shí)達(dá)到高峰。與移植后1 d相比，差異有顯著性意義(P<0.05)。移植14 d后，陽(yáng)性表達(dá)回落，但仍高于正常水平(P<0.05)。

組別1d2d3d7d14d移植靜脈組5.01±0.55.50±1.36.90±1.513.61±1.21)14.20±1.81)對(duì)照組4.54±0.44.63±0.94.52±0.84.78±0.54.69±0.7

1)與移植后1、2、3 d及對(duì)照組比較，P<0.05

各組不同時(shí)期移植靜脈內(nèi)膜、中膜CDK2、CDK4陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率見(jiàn)表2。

表2不同時(shí)期移植靜脈內(nèi)膜、中膜CDK2、CDK4陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率

Tab 2 Expression of positive cell in grafted vein (±s, %)

1)與移植后1 d及對(duì)照組比較，P<0.05

2.3 移植靜脈中CDK2、CDK4基因表達(dá)的變化

2.3.1 CDK2、CDK4基因電泳結(jié)果:CDK2基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。同一泳道中CDK2基因的表達(dá)產(chǎn)量自術(shù)后第2天普遍高于內(nèi)對(duì)照β-actin表達(dá)產(chǎn)量，靜脈移植術(shù)后7～14 d為CDK2基因表達(dá)的高峰。CDK4基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見(jiàn)圖2。同一泳道中CDK4基因的表達(dá)自術(shù)后第2天產(chǎn)量普遍高于內(nèi)對(duì)照β-actin表達(dá)產(chǎn)量，靜脈移植術(shù)后7～14 d為CDK4基因表達(dá)的高峰。

圖1 CDK2基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

Fig 1 CDK2 gene amplification product of RT-PCR on electrophoresis

Marker為DNA Marker DL2000，由DNA片段2000 bp、1000 bp、750 bp、500 bp、250 bp以及100 bp構(gòu)成。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度430 bp。Ladder 1-5分別為靜脈移植術(shù)后1 d、2 d、3 d、7 d、14 d擴(kuò)增結(jié)果，Ladder 6為正常對(duì)照靜脈，擴(kuò)增結(jié)果為陰性。

圖2 CDK4基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

Fig 2 CDK4 gene amplification product of RT-PCR on electrophoresis

Marker為DNA Marker DL2000，由DNA片段2000 bp、1000 bp、750 bp、500 bp、250 bp以及100 bp構(gòu)成。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度320 bp。Ladder 1-5分別為靜脈移植術(shù)后1 d、2 d、3 d、7 d、14 d擴(kuò)增結(jié)果，Ladder 6為正常對(duì)照靜脈，擴(kuò)增結(jié)果為陰性。

2.3.2 CDK2、CDK4基因表達(dá)半定量分析結(jié)果：CDK2、CDK4基因表達(dá)半定量分析結(jié)果見(jiàn)表3、4。CDK2、CDK4的基因表達(dá)產(chǎn)量在靜脈移植后1 d就開(kāi)始增加，7～14 d達(dá)到高峰。與3 d內(nèi)表達(dá)比較，差異有顯著性意義(P<0.05)。

表3 CDK2基因表達(dá)半定量分析結(jié)果

1)與移植后1、2、3 d比較，P<0.05

表4 CDK4基因表達(dá)半定量分析結(jié)果Tab 4 Semi-quantitative result analysis of CDK4 gene expression

1) 與移植后1、2、3 d比較，P<0.05

3 討 論

移植靜脈IH是一個(gè)多因素、多途徑共同參與的復(fù)雜病理過(guò)程，可能由于取材和吻合的機(jī)械性作用、局部血流動(dòng)力學(xué)改變和炎癥反應(yīng)等原因引起的內(nèi)皮細(xì)胞受損及凝血系統(tǒng)活化而誘發(fā)。中膜SMC的遷移和增殖是IH形成的核心環(huán)節(jié)和必要條件[5]。目前認(rèn)為,任何細(xì)胞發(fā)生增殖均要經(jīng)過(guò)細(xì)胞周期。細(xì)胞周期分為以下不同的時(shí)相: G0期(靜止期) 、G1期(DNA 合成前期) ,S期(DNA 合成期) 、G2期(DNA 合成后期) 和M期 (有絲分裂期) 。多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子影響著細(xì)胞周期進(jìn)展,而細(xì)胞周期的每一個(gè)時(shí)相又受不同的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)控。

對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖的調(diào)控機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞增殖周期的完成依賴于CDK的表達(dá)和激活,它作為催化亞基與調(diào)節(jié)亞基周期蛋白 (Cyclins) 構(gòu)成多種全酶來(lái)發(fā)揮作用。CDK 是細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的中心分子,有三條調(diào)節(jié)途徑：Cyclins 與其結(jié)合活化CDK ;CKIs 與其結(jié)合阻遏CDK活性;細(xì)胞因子磷酸化、去磷酸化CDK調(diào)控其活性。CDK是有磷酸化作用的激酶，受其調(diào)節(jié)亞基即Cyclin的活化。兩者形成Cyclin-CDK復(fù)合物，即具有磷酸化的活性?？傊?大量增殖的外膜平滑肌細(xì)胞和遷移入內(nèi)膜下的VSMC 均表現(xiàn)出不同程度、多種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá),這些調(diào)節(jié)蛋白控制著VSMC 的增殖特性,與動(dòng)脈硬化的形成有十分密切的關(guān)系,有待更深入的研究探討[6-11]。

本實(shí)驗(yàn)所采用的大鼠自體靜脈移植模型是較為公認(rèn)的整體動(dòng)物模型，與臨床實(shí)踐中以自體靜脈為移植物的各種旁路轉(zhuǎn)流術(shù)相似。細(xì)胞周期中有兩個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)折點(diǎn)：一是G1期進(jìn)入S期，稱為“起始點(diǎn)”，位于G1末期，此時(shí)DNA開(kāi)始合成；二是G2期進(jìn)入M期，稱為“進(jìn)入點(diǎn)”，位于M期起始部位，此時(shí)細(xì)胞開(kāi)始分裂。CDK表達(dá)及活性的調(diào)控是細(xì)胞周期調(diào)控的核心,其中CDK2和CDK4主要作用于G1期和S期,具有啟動(dòng)DNA 復(fù)制和誘發(fā)有絲分裂的雙重作用。檢測(cè)結(jié)果表明了CDK2、CDK4基因在移植靜脈早期表達(dá)就開(kāi)始增加，且與移植后內(nèi)膜增生的病理過(guò)程一致，在7～14 d達(dá)到高峰。說(shuō)明了CDK2、CDK4基因在移植靜脈內(nèi)膜增生的病理過(guò)程中可能起到了重要作用。細(xì)胞周期是增殖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的最終共同通路,進(jìn)入細(xì)胞周期和細(xì)胞周期的推進(jìn)是血管增殖性疾病中的關(guān)鍵事件。VSMC 進(jìn)入增殖狀態(tài),不僅伴隨著細(xì)胞周期的推進(jìn),還伴隨著化學(xué)趨化因子和粘附分子的表達(dá)以及細(xì)胞外基質(zhì)的調(diào)節(jié)。因此,以細(xì)胞周期為靶點(diǎn),牢牢控制VSMC 增殖周期將有望防治再狹窄的發(fā)生和發(fā)展。CDK2、CDK4基因可能是有希望的靶基因。已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道在動(dòng)脈球囊損傷模型中應(yīng)用反義CDK2基因可以抑制內(nèi)膜增生。在G1期/S期CDK2、CDK4基因共同表達(dá)增加，也說(shuō)明了細(xì)胞周期的推進(jìn)和內(nèi)膜增生是多種基因相互作用的結(jié)果，多基因多環(huán)節(jié)的聯(lián)合基因治療可能是今后的研究方向。

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