劉丹丹，姜 悅，劉 奔，劉純青，魏 巍，張艷麗，>趙心宇，趙寶霞，孟秀香

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 診斷學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，遼寧 大連116044；2.黑龍江省雙鴨山市疾控中心，黑龍江 雙鴨山155100；3.大連醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連116044；4.山東省濟(jì)南市第五人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，山東 濟(jì)南250022)

Bmi-1基因(B-cell-specific Moloney murine leukemia virus insertion site 1)是多梳基因(polycomb group genes，PcG)家族中重要成員之一[1]。Bmi-1基因決定著某些腫瘤干細(xì)胞自我更新能力，如白血病干細(xì)胞[2]、神經(jīng)腫瘤干細(xì)胞[3]和乳腺癌干細(xì)胞[4]等。很多臨床研究發(fā)現(xiàn)Bmi-1基因與多種腫瘤關(guān)系密切，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌、肝癌、直腸癌及胃癌等中均發(fā)現(xiàn)Bmi-1表達(dá)較正常組織增高，且這種表達(dá)的增高與腫瘤組織特性(如癌組織大小、分期分級(jí)、病程、轉(zhuǎn)移程度等)的相關(guān)性研究表明，Bmi-1與腫瘤的惡性程度、侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后關(guān)系密切[5-7]。本文旨在研究Bmi-1 siRNA沉默Hela細(xì)胞中Bmi-1表達(dá)對(duì)Hela細(xì)胞增殖能力的影響，并探討其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 siRNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染

根據(jù)GENEBANK中的Bmi-1 mRNA Sequence NM_005180，設(shè)計(jì)4條Bmi-1 siRNA序列和一條隨機(jī)序列的陰性對(duì)照(表1)。將合成siRNA小片段與進(jìn)行BamHI+HindIII雙酶切的質(zhì)粒pGenesil-2進(jìn)行表達(dá)載體連接，獲得連接有各siRNA小片段的重組質(zhì)粒。利用FuGENE?HD 試劑(Roche公司)將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入Hela細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染siRNA干擾質(zhì)粒的Hela細(xì)胞分別命名為Hela-S1、Hela-S2、Hela-S3、Hela-S4細(xì)胞，轉(zhuǎn)染隨機(jī)系列陰性對(duì)照質(zhì)粒的Hela細(xì)胞命名為Hela-V細(xì)胞，未轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞命名為Hela-W細(xì)胞。將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度孵箱中培養(yǎng)。質(zhì)粒pGensil-1(由武漢晶賽公司提供)含有EGFP基因能表達(dá)熒光蛋白，用于熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。

表1 Bmi-1 siRNA序列Tab 1 The siRNA target sequence of Bmi-1 gene

1.2 Bmi-1mRNA水平檢測(cè)

采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測(cè)Bmi-1 mRNA。Bmi-1基因上游引物：5′-TCATCCTTCTGCTGATGCTG-3′，Bmi-1基因下游引物：5′-GCATCACAGTCATTGCTGCT-3′，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為221 bp。以GAPDH作為內(nèi)參照基因；GAPDH上游引物：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，GAPDH下游引物：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為226 bp。引物由大連寶生物公司合成。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳。紫外凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果。電泳條帶強(qiáng)度由圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.3 蛋白水平檢測(cè)

采用Western blot法。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，按南京KEYGEN公司的說(shuō)明書提取蛋白。蛋白樣品經(jīng)15%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酞胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)至PVDF膜(Millipore 公司)，之后與一抗(Bmi-1，CyclinD1，β-actin，Abcam公司)室溫振蕩孵育2 h，再分別與相應(yīng)二抗(北京中杉公司)37 ℃孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光試劑(北京普利萊公司)檢測(cè)陽(yáng)性信號(hào)，拍照，凝膠圖像處理系統(tǒng)分析。

1.4 細(xì)胞存活率檢測(cè)

轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，用0.4%臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)行染色，分別計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中的死亡細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.5 增殖能力的檢測(cè)

采用MTT法檢測(cè)Hela細(xì)胞的增殖能力。轉(zhuǎn)染48 h后，取4組細(xì)胞接種在96孔板中，1 d后每孔加入MTT 10 μL培養(yǎng)4 h，然后加入150 μL DMSO，待結(jié)晶完全溶解后，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，檢測(cè)波長(zhǎng)為492 nm。連續(xù)測(cè)5 d。

1.6 細(xì)胞周期的檢測(cè)

轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，用70%乙醇4 ℃固定24 h，加入RNA酶(終濃度50 μg/mL)，37 ℃1 h。加入碘化丙啶(PI，濃度100 μg/mL)溶液染色20～30 min后，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.7 克隆形成能力檢測(cè)

采用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)：轉(zhuǎn)染48 h后，在六孔板的每個(gè)孔中加入400個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)10 d待細(xì)胞形成克隆后，10%甲醛固定20 min后加入結(jié)晶紫染液染15 min，用數(shù)碼相機(jī)拍照。計(jì)數(shù)肉眼可見的集落數(shù)。

1.8 Ki-67的檢測(cè)

Ki-67一抗購(gòu)自SANTA CRUZ公司；二抗及DAB顯色試劑盒均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。將已消毒的蓋玻片置于培養(yǎng)皿中，加入細(xì)胞懸液后正常培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行爬片，2 d后免疫組織化學(xué)SP法進(jìn)行染色。具體操作步驟(按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行)如下：PBS中清洗爬片3次，4%多聚甲醛固定，PBS清洗，0.5%Triton X-100透膜處理，正常非動(dòng)物免疫血清封阻，加Ki-67抗體4 ℃孵育過(guò)夜。次日，分別與二抗及鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶常溫孵育，再經(jīng)DAB顯色、蘇木染、梯度酒精脫水、二甲苯透明，最后以中性樹脂封片，復(fù)光鏡

下觀察。此外，陰性對(duì)照片以PBS代替一抗。根據(jù)染色強(qiáng)度即棕色的強(qiáng)弱來(lái)進(jìn)行定性判斷。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用mean±SD表示，采用方差分析對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染Bmi-1 siRNA后轉(zhuǎn)染效果的觀察

轉(zhuǎn)染48 h后，提取6組細(xì)胞總RNA，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)檢測(cè)Neo基因的表達(dá)，結(jié)果見圖1。Hela-S1、Hela-S2、Hela-S3、Hela-S4及Hela-V細(xì)胞中均有Neo基因的表達(dá)，而Hela-W細(xì)胞中未見Neo基因的表達(dá)。同時(shí)將質(zhì)粒pGensil-1轉(zhuǎn)染入Hela細(xì)胞，48 h后，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率(圖2)。轉(zhuǎn)染效率達(dá)90%左右。

圖1 6組細(xì)胞中Neo基因表達(dá)結(jié)果

Fig 1 Confirmation of plasmid transfection by antineomycin mRNA expression Lane M：DL2000；Lane 1、Lane 2、Lane 3、Lane 4、Lane 5、Lane 6分別為Hela-S1、Hela-S2、Hela-S3、Hela-S4、Hela-V和Hela-W

圖2 質(zhì)粒pGensil-1轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后熒光觀察 ×100Fig 2 Efficiency of plasmid transfection ×100

2.2 轉(zhuǎn)染Bmi-1 siRNA對(duì)Bmi-1表達(dá)的影響

轉(zhuǎn)染48 h后，提取6組細(xì)胞總RNA，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)檢測(cè)Bmi-1與GAPDH mRNA的水平，結(jié)果見圖3A。結(jié)果顯示：Hela-S1、Hela-S2、Hela-S3和Hela-S4細(xì)胞中Bmi-1 mRNA表達(dá)量與Hela-V和Hela-W兩組細(xì)胞比較差異有顯著性意義，P<0.01。Hela-V組與Hela-W組比較差異無(wú)顯著性意義，P>0.05。Western blot分析6組細(xì)胞中Bmi-1與β-actin蛋白的表達(dá)見圖3B。結(jié)果顯示，Hela-S1、Hela-S2、Hela-S3和Hela-S4細(xì)胞中Bmi-1蛋白表達(dá)量與Hela-V和Hela-W兩組細(xì)胞比較差異有顯著性意義，P<0.05;而Hela-W與Hela-V組比較差異無(wú)顯著性意義，P>0.05。

圖3 siRNA對(duì)Hela細(xì)胞Bmi-1表達(dá)的影響Fig 3 Effects of Bmi-1 siRNA on Bmi-1 expression and protein translation in Hela cellsA：Bmi-1 mRNA表達(dá)；B：Bmi-1蛋白表達(dá)

如圖3所示，4條干擾鏈均能抑制Hela細(xì)胞中Bmi-1 mRNA及Bmi-1蛋白的表達(dá)，選用Hela-S1鏈和Hela-S3鏈進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 轉(zhuǎn)染Bmi-1 siRNA對(duì)Hela細(xì)胞增殖的影響

臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)細(xì)胞的存活率，轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性意義，P>0.05(圖4A)。MTT法結(jié)果顯示：第2天開始Hela-S1和Hela-S3細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯減慢(P<0.05)，而Hela-W與Hela-V組比較差異無(wú)顯著性意義，P>0.05(圖4B)。流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布結(jié)果為：Hela-W和Hela-V細(xì)胞G0-G1期比率是(54.73±4.19)%和(54.96±5.37)%，Hela-S1和Hela-S3組的比率則分別為(76.92±8.25)%和(77.85±6.32)%。與Hela-W和Hela-V比較差異有顯著性意義，P<0.05，而Hela-W與Hela-V組比較差異無(wú)顯著性意義，P>0.05。

圖4 Bmi-1 siRNA對(duì)Hela細(xì)胞增殖的影響Fig 4 Effects of Bmi-1 siRNA on proliferation of Hela cellsA：臺(tái)盼藍(lán)實(shí)驗(yàn)結(jié)果；B:細(xì)胞生長(zhǎng)曲線*與其他兩組細(xì)胞相比P<0.05

2.4 轉(zhuǎn)染Bmi-1 siRNA對(duì)Hela細(xì)胞體外克隆形成能力的影響

將Hela-S1、Hela-S3、Hela-W、Hela-V各組400個(gè)細(xì)胞接種于六孔板中，10 d后各組細(xì)胞形成的集落經(jīng)結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)肉眼可見的克隆數(shù)目，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Hela-S1、Hela-S3細(xì)胞形成的克隆數(shù)目與對(duì)照組比較差異有顯著性意義，P<0.01，克隆的直徑明顯變小，見圖5。

圖5 Bmi-1 siRNA對(duì)Hela細(xì)胞集落形成的影響Fig 5 Effects of Bmi-1 siRNA on colony formation of HeLa cells

2.5 轉(zhuǎn)染Bmi-1 siRNA對(duì)Hela細(xì)胞Ki-67及CyclinD1表達(dá)的影響

組化染色結(jié)果顯示Bmi-1沉默后Ki-67明顯下降(圖6)；Western blot結(jié)果表明：Bmi-1沉默后CyclinD1表達(dá)亦明顯下降(圖7)。

圖6 Bmi-1 siRNA對(duì)Hela細(xì)胞Ki-67表達(dá)的影響

圖7 Bmi-1 siRNA對(duì)Hela細(xì)胞CyclinD1表達(dá)的影響

Fig 7 Effect of Bmi-1 siRNA on CyclinD1 expression of Hela cells were analyzed by Western blot

3 討 論

Xiao J等[8]發(fā)現(xiàn)沉默Bmi-1表達(dá)能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖與侵襲，筆者在前期研究中也發(fā)現(xiàn)反義RNA能夠抑制肺腺癌系A(chǔ)549細(xì)胞的增殖[9]。本研究設(shè)計(jì)了4對(duì)針對(duì)Bmi-1基因的siRNA及陰性對(duì)照的siRNA。發(fā)現(xiàn)這4條Bmi-1 siRNA均能沉默Hela細(xì)胞Bmi-1基因的表達(dá)，便隨機(jī)選用Hela-S1、Hela-S3條Bmi-1 siRNA作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

臺(tái)盼藍(lán)結(jié)果顯示，干擾組與對(duì)照組死亡細(xì)胞率相比差異無(wú)顯著性意義，說(shuō)明Bmi-1 siRNA不會(huì)引起Hela細(xì)胞的死亡。MTT結(jié)果顯示，第2天開始Hela-S1、Hela-S3細(xì)胞的A值與對(duì)照組相比明顯降低，生長(zhǎng)速度明顯減慢。說(shuō)明Bmi-1 siRNA是通過(guò)抑制Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)速度來(lái)抑制其增殖的。而應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞周期分布情況的結(jié)果顯示，表達(dá)Bmi-1 siRNA的質(zhì)粒使停滯于G0-G1期的Hela細(xì)胞明顯增多。說(shuō)明Bmi-1 siRNA可能是通過(guò)阻斷細(xì)胞周期來(lái)抑制Hela細(xì)胞增殖的。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Hela-S1、Hela-S3細(xì)胞形成的克隆數(shù)目與對(duì)照組相比明顯減少(P<0.01)，克隆的直徑明顯變小，表明Bmi-1 siRNA抑制Hela細(xì)胞中Bmi-1基因的表達(dá)對(duì)Hela細(xì)胞自我更新能力產(chǎn)生了明顯的抑制作用。

Bmi-1和腫瘤發(fā)生之間最直接的聯(lián)系就是Bmi-1可以抑制Ink4a/Arf位點(diǎn)的表達(dá)，并因此調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖。Ink4a/Arf位點(diǎn)是Bmi-1的經(jīng)典靶基因，該位點(diǎn)可編碼2種蛋白質(zhì)：p16Ink4a和p19arf(在人類為p14Arf)。最近Wu J等[10]發(fā)現(xiàn)Bmi-1可通過(guò)p16ink4a/CDK4通路調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞的增殖。而Xu Z等[11]發(fā)現(xiàn)Bmi-1還可通過(guò)調(diào)節(jié)CyclinD1等細(xì)胞周期蛋白參與乳腺癌細(xì)胞的增殖。本研究結(jié)果顯示Bmi-1表達(dá)沉默的同時(shí)，CyclinD1表達(dá)明顯下降，Bmi-1是通過(guò)p16ink4a/CDK4通路還是PI3K/Akt通路來(lái)調(diào)控CyclinD1還有待于進(jìn)一步探討。

Ki-67是一種細(xì)胞核增殖抗原，是公認(rèn)的準(zhǔn)確可靠的監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖狀態(tài)的指標(biāo)，近年來(lái)被認(rèn)為能較有效評(píng)估腫瘤細(xì)胞增殖活性的重要標(biāo)記物之一。因?yàn)槠浒胨テ诓怀^(guò)1 h，陽(yáng)性表達(dá)又覆蓋了各種增殖期細(xì)胞整個(gè)有絲分裂期，能夠減少在檢測(cè)過(guò)程中出現(xiàn)假陰性或假陽(yáng)性的結(jié)果。因而本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了各組Hela細(xì)胞Ki-67的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Bmi-1表達(dá)沉默后Ki-67表達(dá)明顯下降，說(shuō)明二者密切相關(guān)，也為Bmi-1促進(jìn)Hela細(xì)胞增殖提供了更有力的證據(jù)。

本研究利用Bmi-1 siRNA來(lái)干擾Bmi-1基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其抑制了Hela細(xì)胞的體外增殖及克隆形成能力，同時(shí)Ki-67和CyclinD1的表達(dá)明顯下降，說(shuō)明Bmi-1參與了宮頸癌的發(fā)生過(guò)程。可以推測(cè)Bmi-1有望成為一個(gè)新的宮頸癌細(xì)胞標(biāo)志物和作為針對(duì)腫瘤干細(xì)胞治療的靶基因。

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