熊 莉，孫 瑜，李國(guó)良，唐 綺，肖 莉，吳 紅，翁美芝

(江西省血液中心，江西 南昌 330077)

154例RhD陰性表型個(gè)體的D基因多態(tài)性分析

熊 莉，孫 瑜，李國(guó)良，唐 綺，肖 莉，吳 紅，翁美芝

(江西省血液中心，江西 南昌 330077)

目的研究RhD陰性個(gè)體基因多態(tài)性。方法采用抗人球蛋白試驗(yàn)(IAT)確認(rèn)RhD陰性個(gè)體；對(duì)RhD陰性個(gè)體再運(yùn)用PCR-SSP方法分析其基因分布情況。結(jié)果154例IAT確定為RhD陰性的個(gè)體中，86例所檢測(cè)的外顯子完全缺全(55.84%)、36 例完整(23.38%)、32 例部分缺失(20.78%)；其檢出 DelRhD1227A、弱 D15 型、RHD-CE(2～9)-D、DVa(Has)、DVIⅢ等多種RhD陰性等位基因。結(jié)論江西地區(qū)血清學(xué)RhD陰性人群中存在RHD基因且呈現(xiàn)多態(tài)性，提示可聯(lián)合應(yīng)用血清學(xué)和基因分型兩種方法來(lái)檢測(cè)D抗原。

RhD；基因；多態(tài)性；血型

Rh血型是人類(lèi)最復(fù)雜和最具多態(tài)性的紅細(xì)胞血型系統(tǒng)，該血型至少由57種不同的抗原組成。D抗原是免疫原性最強(qiáng)的Rh血型抗原，在臨床輸血、新生兒溶血等方面有重大意義。因此，鑒定RhD抗原表型被列為臨床輸血常規(guī)檢查[1]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)不同種族在抗人球蛋白試驗(yàn)確認(rèn)為RhD陰性的個(gè)體中仍存在RHD基因[2，3]，提示RhD陰性個(gè)體存在遺傳多態(tài)性并具有廣泛的種族背景差異。我們對(duì)江西地區(qū)154例RhD陰性樣本進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)并應(yīng)用PCR-SSP技術(shù)分析RHD基因型，以探討江西個(gè)體RhD陰性的分子基礎(chǔ)，以期發(fā)現(xiàn)其多態(tài)性規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 154份RhD陰性無(wú)親緣關(guān)系的血液樣本均取自江西省血液中心的健康無(wú)償獻(xiàn)血者。

1.2 血清學(xué)RhD陰性確認(rèn) 對(duì)初篩為RhD陰性的標(biāo)本采用抗人球蛋白試驗(yàn)，至少用3種以上抗D血清進(jìn)行Rh陰性確認(rèn)。(北京金豪,Lot:201109096，上海血液生物，Lot:20111212,Milliore,Lot：BMB1101J)

1.3 基因組DNA提取 取乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血，用Texas基因組DNA抽提試劑盒分離獲得，-20℃保存待用。

1.4 Rh血型基因分型 采用天津市秀鵬生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司的紅細(xì)胞RHD陰性鑒定基因檢測(cè)試 劑 盒 (檢 測(cè) RHD 基 因 1、5、6、7 外 顯 子 ，Lot：1109，有效期：20120915)，對(duì) 154 例血清學(xué)確認(rèn)為RhD陰性的標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像儀觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

154 例間接抗人球蛋白試驗(yàn)(IAT)確定為RhD陰性的個(gè)體中，86例所檢測(cè)的外顯子完全缺全(55.84%)、36 例 完 整 (23.38%)、32 例 部 分 缺 失(20.78%)； 其檢出弱 D15型 1例 (0.65%)，Del-RhD1227A 型 26 例 (16.88%)，RhD+9 例 (5.84%)，RHD-CE(2～9)-D16 例 (10.39%)，DVa(Has)1 例(0.65%)，DVIⅢ1 例(0.65%)。 見(jiàn)表 1。

表1 表型RhD陰性個(gè)體RHD外顯子及等位基因分析

3 討論

Rh血型基因位于染色體 1p34.3～36.1，由RHCE和RHD兩個(gè)高度同源結(jié)構(gòu)基因組成，各含有10個(gè)外顯子，二者核苷酸序列同源性高達(dá)96%。兩基因差異最大的區(qū)域位于外顯子4，5，7，10及內(nèi)含子4，與RHCE基因相比，RHD基因內(nèi)含子4中有1個(gè)649bp序列的缺失。

目前發(fā)現(xiàn)歐洲白種人以高加索人為代表，絕大多數(shù)完全缺失RHD基因，屬最常見(jiàn)型，這也代表了絕大部分RhD陰性的機(jī)制；非洲黑人則以RHDψ基因、RHD-CE-D雜交基因這兩種情況為主；在東亞黃種人中，特別是日本人、韓國(guó)人、中國(guó)臺(tái)灣、香港和大陸人主要有3種情況：RHD基因完全缺失、RHD基因部分缺失、RHD基因完整無(wú)缺失。其中RhD陰性基因多態(tài)性表現(xiàn)為RHD-CE(2～9)-D2、DEL(1227A)、RHD710delC、RHD(M295I)、RHD(X418L)等多種等位基因形式。

本研究顯示，154份經(jīng)抗人球蛋白試驗(yàn)確認(rèn)為RhD陰性的樣本中55.84%完全缺失D基因，23.38%D基因外顯子完整,20.78%D基因部分缺失，與廣東、福建報(bào)道的相關(guān)數(shù)據(jù)相似[4，5]。 其中RHD基因完整無(wú)缺失中以DEL(1227A)等位基因?yàn)橹?，占RhD陰性樣本的16.88%。DEL(1227A)是RHD基因第9外顯子最后1個(gè)堿基發(fā)生突變即1227G>A，導(dǎo)致正常的RHD基因讀碼框發(fā)生改變從而影響了mRNA的拼接導(dǎo)致Rh抗原的表達(dá)異常。我國(guó)人群中，97.1%的DEL型為l227G>A突變，這為PCR-SSP檢測(cè)其突變位點(diǎn)提供了良好的平臺(tái)，因此基因分型方法已成為未來(lái)檢測(cè)DEL型的趨勢(shì)[6]。另外，還發(fā)現(xiàn)有弱D15型、DVa(Has)、RHD-CE(2～9)-D、DVIⅢ等多種RhD陰性等位基因表現(xiàn)形式，與深圳地區(qū)RhD陰性基因型分布情況接近[7]?；蚪Y(jié)構(gòu)呈明顯的多態(tài)性，這一結(jié)果與以往中國(guó)廣東[8]、臺(tái)灣[9]和海南[10]報(bào)道一致，表明不同地區(qū)中國(guó)人具有相同的Rh血型遺傳背景。另外，還有14例標(biāo)本未能確定RhD陰性的分子基礎(chǔ)，可能與實(shí)驗(yàn)操作或試劑盒的局限性有關(guān)，將在以后的工作中確認(rèn)完善。

近幾年,研究者發(fā)現(xiàn)一些RhD陰性個(gè)體中能檢出RhD基因,這些個(gè)體擁有D基因,卻不表達(dá)D抗原,推測(cè)有兩個(gè)方面的原因：一是RHD基因存在核苷酸片段的插入、缺失或者替換導(dǎo)致無(wú)義突變[8,11]，二是這些個(gè)體并非真實(shí)的RhD陰性，而是因D抗原較弱，吸收放散試驗(yàn)也未能檢出，比如本研究中9例外顯子表現(xiàn)為RhD陽(yáng)性的陰性個(gè)體。

本研究說(shuō)明在中國(guó)人中,RhD陰性個(gè)體RHD基因存在著多態(tài)性,針對(duì)白種人RhD陰性機(jī)制只測(cè)定幾個(gè)外顯子的RHD基因定型試劑盒并不適合中國(guó)人。因此當(dāng)PCR-SSP出現(xiàn)無(wú)法解釋的結(jié)果或需要確認(rèn)具體的弱D型或部分D型別時(shí)，必須進(jìn)一步通過(guò)RHD基因序列分析。在臨床應(yīng)用中，特別是在預(yù)測(cè)新生兒溶血病中要特別注意基因定型的假陽(yáng)性和假陰性問(wèn)題。鑒于輸血醫(yī)學(xué)關(guān)系到受血者的寶貴生命，不容絲毫差錯(cuò)，因此我們認(rèn)為在中國(guó)RHD基因分型方法尚未成熟，在完全替代RhD表型血清學(xué)檢測(cè)之前仍需對(duì)中國(guó)人RHD基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入研究，以建立適合本地區(qū)人群RHD基因分型策略。

[1]杰夫·丹尼爾主編.朱自嚴(yán)主譯.人類(lèi)血型[M].北京:科學(xué)出版社,2007:259-260.

[2]Okuda H，Kawano M，Lwamoto S,et a1.The RHD gene is highly detectable in RhD-negative Japanese donors[J].J Clin Invest,1997,100(2):373-379.

[3]徐 群,張世訓(xùn),張建業(yè),等.中國(guó)漢族群體RhD陰性個(gè)體D基因外顯子多態(tài)性研究[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志,2001,18(1):39-42.

[4]周華友,蘭炯采,王曉珠，等.人 RHD基因外顯子多態(tài)性研究[J].第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，24(5):513-516.

[5]卓傳尚,卓孝福,郭永建，等.福建省RhD陰性個(gè)體RhD基因多態(tài)性[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志,2008,16(2):435-438.

[6]陸松松，陳靜嫻.Rh(D)變異體的研究進(jìn)展[J].臨床輸血與檢驗(yàn),2010,12(4):374-377.

[7]周一炎，邵超鵬.深圳地區(qū)獻(xiàn)血者Rh表型和基因型分布調(diào)查[J].臨床輸血與檢驗(yàn),2003,5(4):244-247.

[8]蘭炯采,王從窯,魏亞明,等.中國(guó)漢族Rh血型基因多態(tài)性觀察[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2003,11(6):642-645.

[9]Chen JC,Lin TM,Chen YL,et al.RHD 1227A is an important genetic marker for RhDel individuals[J].Am J Clin Pathol,2004,122:193-198.

[10]葉健忠,楊向萍,蔡于旭,等.海南漢族RhD陰性個(gè)體RHD基因研究[J].中國(guó)輸血雜志,2005,18(2)：97-100.

[11]Avent ND,Martin PG,Armstrong-Fisher SS,et al.Evidence of genetic diversity underlying RhD,weak D and partial D phenotypes as determined by multiplex polymerase chain reaction analysis of the RHD gene[J].Blood,1997,89(7):2568-2577.

R457.1+1,Q346+.5

A

1674-1129(2012)04-0340-02

10.3969/j.issn.1674-1129.2012.04.006

江西省衛(wèi)生廳科技資助(20082010)

熊莉，女，1982年出生，碩士，主治醫(yī)師，主要從事輸血醫(yī)學(xué)研究。