呂金印,邸麗俊,葉慶富 (1.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,陜西 楊凌 712100；2.陜西理工學(xué)院科技處,陜西 漢中 72000；.浙江大學(xué)原子核農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,浙江 杭州 10029)

鎘是生物毒性顯著的重金屬元素之一[1],在植物體內(nèi)積累到一定程度時(shí)就會引起植株根系發(fā)育不良[2]、光合速率下降[3],細(xì)胞內(nèi)的活性氧代謝失衡,葉片中丙二醛含量隨鎘濃度升高而逐漸升高[4],從而影響蛋白質(zhì)的合成、運(yùn)輸及降解代謝過程[5].還原型谷胱甘肽和脯氨酸含量是典型的逆境生理指標(biāo),在受到鎘污染時(shí)植物體內(nèi)還原型谷胱甘肽和脯氨酸含量增加,以應(yīng)對重金屬的毒害效應(yīng).基因組DNA作為遺傳信息的載體,最大的特點(diǎn)之一就是穩(wěn)定性,然而鎘污染會對細(xì)胞DNA造成損傷,由此影響遺傳信息的傳遞.鎘進(jìn)入細(xì)胞后能引起部分細(xì)胞周期的永久阻滯、凋亡,與 DNA損傷修復(fù)有關(guān)[6-8],并直接或間接造成遺傳毒性[9],影響基因表達(dá)調(diào)控與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[10].

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA(RAPD)分析技術(shù)早期被用于檢測害蟲[11]、病毒、大腸桿菌[12-13]及大型藻類[14]中低劑量化學(xué)污染物造成的 DNA構(gòu)象改變所引起的遺傳不穩(wěn)定性.目前,該技術(shù)已廣泛用于東南景天屬植物的品種分類[15]、遺傳作圖[16]、土壤酶活性、微生物群落結(jié)構(gòu)[17],以及水生生態(tài)系統(tǒng)中鎘污染對斑馬魚等生物體內(nèi) DNA損傷的檢測[18].有關(guān)重金屬污染對植物[19]、尤其是蔬菜作物[20]基因組DNA多態(tài)性的影響研究鮮見報(bào)道.本研究以菜豆幼苗為試材,結(jié)合多種生理指標(biāo),測定不同濃度鎘脅迫下地豆幼苗葉片DNA多態(tài)性的變化,構(gòu)建RAPD評價(jià)體系,探討鎘脅迫對植物生長發(fā)育的影響,旨在為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中鎘污染的預(yù)警與評價(jià)、蔬菜無害化栽培提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)

供試菜豆品種為地豆王2號(購自西安市華星種子公司).挑選籽粒飽滿種子,用 1%H2O2溶液滅菌 10min,經(jīng)無菌水反復(fù)沖洗后,置于培養(yǎng)皿,恒溫培養(yǎng)箱催芽,溫度為:25℃;相對濕度: 70%～75%,待胚根長至 3cm長,移至長×寬×高: 20cm×10cm×8cm水培槽中,加Hoagland營養(yǎng)液,在光合培養(yǎng)室進(jìn)行水培.溫度:晝/夜(27±3)/ (21±3)℃;濕度:(65±5)%;光照:晝/夜 14/10h,光強(qiáng):150μmol/(m2·s).待子葉伸展完全,挑選生長一致的幼苗移入鎘處理水培槽中.植株長至三葉一心時(shí),在同一生長期采用 CdCl2·2.5H2O處理,鎘處理濃度為0,20,40,80mg/L,每盆5株.每個(gè)處理10盆重復(fù).處理7d后采樣,采集的菜豆幼苗樣品用蒸餾水沖洗,吸水紙吸干表面水分.一部分鮮樣用于測定生理指標(biāo);一部分樣品放入烘箱烘干,用于測定生物量及鎘含量;另一部分用液氮冷凍處理后冷凍(-20℃)保存,用于分析 DNA損傷狀況.

1.2 生物量測定

分別采各處理菜豆植株5株,用自來水反復(fù)沖洗,吸水紙吸干表面水分,105℃下殺青 15min, 80℃烘干至恒重,稱根、莖、葉各器官干重.

1.3 鎘含量測定

將 Cd2+處理菜豆幼苗植株分為根、莖、葉三部分,分別用自來水及去離子水沖洗,吸干水分,105℃殺青 15min,80℃烘干至恒重,磨碎混勻,加入HNO3-HClO4(4:1,V/V)混合酸,220℃沙浴消化,利用火焰原子吸收分光光度計(jì)(Z-5000賽曼,日立公司)測定Cd含量[21].

1.4 生理指標(biāo)測定

丙二醛(MDA)含量測定采用TBA比色法[22];可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍(lán) G-250法[23];脯氨酸(Pro)含量測定采用酸性茚三酮顯色法[22];還原型谷胱甘肽(GSH)含量測定采用DTNB顯色法[23].

1.5 菜豆幼苗葉片基因組 DNA 的提取與RAPD圖譜檢測

DNA的提取:稱0.2g菜豆葉片,加液氮充分磨碎,采用CTAB方法提取基因組總DNA.然后,加RNAase對DNA粗提液37℃下消化60min,以去除其中 RNA污染.棄消化后的上清液,沉淀用75%乙醇清洗2次,溶于滅菌雙純水中,進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn).所得的 DNA以紫外分光光度法分別檢測A260和A280,計(jì)算A260/A280,如比值介于1.8～2.0之間則認(rèn)為DNA純度良好.

RAP-PCR擴(kuò)增及檢測:8條隨機(jī)引物、TaqDNA聚合酶及dNTPs均購于大連寶生物工程技術(shù)有限公司.引物編號及堿基序列如下[24-27], P1:d5’(GTGACGTAGG)3’; P2:d5’(CCGAATTCCC)3’;P3:d5’(GGCTGCAGAA)3’;P4:d5’(GGTGCGGGAA)3’; P5: d5’(GCGGTTTTGC)3’; P6:d5’(GGCACTGAGG)3’; P7: d5’(CACTCTCCTC)3’; P8:d5’(CACTCTCCTC)3’.

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的總體積為25μL,其中包括cDNA模板2μL,10×Buffer 2μL,MgCl2(25mmol/L) 2μL, dNTPs (2mmol/L) 2μL,引物(10μmol/L) 2μL, TaqDNA 聚合酶(5U/μL)0.25μL,加 ddH2O 到25μL;擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性 5min后, 94℃變性30s,40℃退火30s,72℃延伸90s,40循環(huán);72℃延伸 7min.采用 1%瓊脂糖凝膠(加入EB使其終濃度為 0.5μg/mL)電泳檢測 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物.

1.6 數(shù)據(jù)處理

耐性指數(shù)(TI)=鎘處理菜豆生物量/對照生物量×100%[28].

根系鎘滯留率(RR)=(地下部分鎘含量-地上部分鎘含量)/地下部分鎘含量×100%[22].

基因組模板穩(wěn)定性(GTS)用下式計(jì)算:GTS= (1-a/n)×100%,式中,a為處理組菜豆幼苗葉片的RAPD多態(tài)性譜帶數(shù),即與對照組相比,處理組新出現(xiàn)的和消失的PCR譜帶之和,n為對照組的總譜帶數(shù)[14].

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用 SPSS16.0軟件進(jìn)行方差分析(ANOVA)和LSD檢驗(yàn),數(shù)值結(jié)果表示用3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度鎘處理對菜豆幼苗生物量的影響

生物量是衡量植株生長對重金屬耐性的重要指標(biāo).本試驗(yàn)中隨著 Cd處理濃度的增加,菜豆幼苗根、莖、葉生物量均呈下降趨勢,中、高濃度Cd處理(40,80mg/L)下葉、根生物量與對照相比差異顯著(P＜0.05)(圖1A),尤其高濃度Cd處理下根生物量下降了 15.3%.而低濃度鎘(20mg/L)處理下菜豆植株生物量與對照差異不大.耐性指數(shù)是指植株對鎘的忍耐程度.本試驗(yàn)中隨著 Cd處理濃度的升高,耐性指數(shù)呈下降趨勢,與生物量變化一致(圖1B).

2.2 不同濃度鎘處理對菜豆幼苗鎘含量的影響

本試驗(yàn)中隨著Cd處理濃度增加,菜豆幼苗植株不同器官中鎘含量上升(圖 2A),尤其在根中增幅較大.與對照相比,20,40,80mg/LCd處理下根中分別增加了9.6、40.8和64.5倍.菜豆不同器官對鎘的吸收累積能力為:根＞葉＞莖.不同濃度鎘處理根系對鎘的滯留率明顯高于對照(圖 2B).可能是降低鎘向地上部位的遷移力,以減輕過量鎘對其他器官的毒害作用,提高植物的忍耐能力.

圖1 不同濃度Cd2+處理對菜豆幼苗生物量及其耐性指數(shù)的影響Fig.1 Effect of different Cd2+ concentration on the biomass and tolerance index in Phaseolus vulgaris seedling

2.3 不同濃度鎘處理對菜豆幼苗生理特性的影響

丙二醛(MDA)通常作為植物對逆境反應(yīng)及細(xì)胞膜脂過氧化程度的重要指標(biāo).本試驗(yàn)中,隨著Cd處理濃度的增加,菜豆葉片MDA含量升高(圖3A),3種Cd濃度(20,40,80mg/L)處理下分別比對照增加了0.3,1.8和0.99倍.

可溶性蛋白和脯氨酸(Pro)是植物體內(nèi)主要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì).一般認(rèn)為,重金屬脅迫影響植物體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝.本試驗(yàn)中,低濃度 Cd (20mg/L)處理下可溶性蛋白含量升高,中、高濃度 Cd(40,80mg/L)處理下蛋白含量下降(圖3B).可能是在低濃度鎘脅迫下誘導(dǎo)產(chǎn)生一些逆境蛋白,高濃度鎘處理下植株體內(nèi)蛋白質(zhì)合成受阻,分解加快.

圖2 不同濃度Cd2+ 處理對菜豆幼苗鎘含量及滯留率的影響Fig.2 Effect of different Cd2+ concentration on the content of Cd and the retention rate in Phaseolus vulgaris seedling

非酶物質(zhì)還原型谷胱甘肽(GSH)是植物細(xì)胞中重要的抗氧化劑之一.GSH可以通過調(diào)節(jié)膜蛋白巰基與二硫鍵化合物的比例,對細(xì)胞膜起保護(hù)作用.本試驗(yàn)中,低、中濃度 Cd(20, 40mg/L)處理下 GSH、Pro含量升高,高濃度Cd(80mg/L)處理下則下降,且降幅顯著(P＜0.05)(圖3C、3D).

2.4 不同濃度鎘處理下菜豆幼苗 DNA純度電泳檢測

泳道a、b、c、d分別代表0,20,40,80mg/L鎘處理;M:代表分子大小標(biāo)準(zhǔn)參照物.

圖3 不同濃度Cd2+ 處理對菜豆幼苗生理特性的影響Fig.3 Effect of different Cd2+ concentration on physiological characteristics in Phaseolus vulgaris seedling

DNA作為生物體主要遺傳物質(zhì),具有相對穩(wěn)定性.對不同鎘脅迫處理的菜豆葉片同條件同批次提取DNA,進(jìn)行電泳檢測(圖4),對照組條帶亮度清晰銳利,沒有拖尾,表明提取的DNA完整性良好,沒有降解.20,40mg/L鎘處理下,DNA樣品也保持了較好的完整性.但在 80mg/L鎘濃度處理下,DNA條帶出現(xiàn)大幅彌散和拖尾,表明高濃度鎘脅迫影響菜豆植株體內(nèi)的遺傳物質(zhì)合成和儲存,引起 DNA大量降解.

圖4 不同濃度Cd2+處理下菜豆幼苗DNA電泳檢測Fig.4 Electrophoretogram of genomic DNA extracted by CTAB in leaves of Phaseolus vulgaris seedling under different Cd2+ concentration

2.5 基因組DNA多態(tài)性(RAPD)分析

為進(jìn)一步分析鎘脅迫對DNA層面的損傷,本試驗(yàn)對同批次提取的DNA進(jìn)行遺傳標(biāo)記多態(tài)性分析,選用8條隨機(jī)引物P1～P8,以葉片提取的DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng),圖5和表1顯示8條隨機(jī)引物都獲得了良好穩(wěn)定的多態(tài)性譜帶.鎘處理下DNA多態(tài)性譜帶與正常植株相比存在明顯差異.與正常植株相比,20,40mg/L Cd處理后多態(tài)性譜帶已經(jīng)發(fā)生明顯偏移(如圖5所示,“＋”代表新出現(xiàn)的條帶,“－”代表消失的條帶,“I”代表帶強(qiáng)增強(qiáng)的條帶,“D”代表帶強(qiáng)減弱的條帶),引物 P1、P2、P3、P4、P6、P7、P8的多態(tài)性譜帶中的部分條帶出現(xiàn)缺失,引物P1、P4、P6、P7的多態(tài)性譜帶中還出現(xiàn)了新的條帶,此外P3、P4、P5、P6、P7、P8的某些條帶還出現(xiàn)增加或強(qiáng)弱的現(xiàn)象,說明中低濃度的Cd處理就已經(jīng)對基因組DNA造成了一定的損傷.當(dāng)Cd濃度提高至80mg/L后,8條引物中幾乎所有的譜帶都消失了,說明此時(shí)的DNA模板已經(jīng)受到了非常嚴(yán)重的損傷.以表1數(shù)據(jù)為基準(zhǔn),根據(jù)公式計(jì)算基因組模板的穩(wěn)定性(圖6).20,40mg/L Cd處理后,基因組已經(jīng)出現(xiàn)不穩(wěn)定,穩(wěn)定性僅為69.6%和60.9%,80mg/L處理后基因組出現(xiàn)大面積崩潰,穩(wěn)定性降為2.1%.

圖5 不同濃度鎘處理下菜豆幼苗葉片RAPD圖譜Fig.5 RAPD profiles of DNA from leaves of Phaseolus vulgaris seedling under different Cd2+ concentration

圖6 菜豆幼苗葉片基因組模板穩(wěn)定性(%)Fig.6 The Stability of genome template of Phaseolus vulgaris seedling (%)

表1 鎘處理下菜豆幼苗葉片基因組多態(tài)性變化Table 1 Changes of total bands in control, polymorphic bands and varied bands in Cd-contaminated in leaves of phaseolus vulgaris seedlings

3 討論

鎘是植物非必需元素,其毒害效應(yīng)已受到人們的廣泛關(guān)注[6].鎘污染會對農(nóng)作物生理生化上造成不同程度的影響.

一般認(rèn)為,植物在逆境下受傷害越嚴(yán)重, MDA含量越高[29].本試驗(yàn)中,MDA含量隨著鎘處理濃度的上升而增加,說明鎘脅迫已對膜系統(tǒng)造成損傷.還原型谷胱甘肽(GSH)對鎘脅迫的解毒起關(guān)鍵作用.高等植物產(chǎn)生的植物螯合肽(PC)是鎘解毒的廣泛機(jī)制[30],而還原型谷胱甘肽(GSH)是 PC的合成前體,同時(shí)也可以與金屬離子直接絡(luò)合,其水平?jīng)Q定植物自身解毒能力的強(qiáng)弱.本試驗(yàn)中,在低、中濃度鎘處理(20,40mg/L)下菜豆幼苗體內(nèi)GSH含量升高,高濃度Cd2+(80mg/L)處理下 GSH含量下降,且降幅顯著.Liu等[19]認(rèn)為,隨鎘含量升高,大麥幼苗根系生長及可溶性蛋白總量均受到抑制.本試驗(yàn)表明,低濃度鎘處理下,可溶性蛋白及Pro含量略增,中、高濃度則下降.可溶性蛋白和 Pro的變化趨勢與我們在芹菜中的研究結(jié)果一致[22].

基因組 DNA是遺傳信息的載體,具有遺傳穩(wěn)定性,但是鎘污染會造成DNA損傷,從而干擾遺傳信息的順利傳遞.鎘等重金屬進(jìn)入生物體內(nèi),干擾生殖過程中的細(xì)胞周期[7],如DNA復(fù)制、有絲分裂、原生質(zhì)體的子細(xì)胞分裂和形成等,且與鎘離子呈劑量-依賴關(guān)系[9].在早期的研究中,Williams等分別采用象鼻蟲[11]、擬南芥[31]、大嘴鱸魚[32]建立RAPD模型,用以分析DNA損傷,即RAPD圖譜表現(xiàn)為譜帶強(qiáng)度增或減,譜帶的消失或新增.本試驗(yàn)與 Liu等[19]對鎘處理大麥幼苗 DNA損傷結(jié)果相類似.在低、中濃度鎘處理下,DNA樣品保持了較好的完整性.但在高濃度鎘(80mg/L)處理下,DNA條帶出現(xiàn)彌散和拖尾,可能是由于高濃度鎘造成基因組DNA的大面積斷裂和崩潰,形成許多彌散小片段DNA.

RAPD圖譜的變化趨勢可以定性的衡量基因組模板DNA的穩(wěn)定性[33].本研究表明,低濃度鎘(20mg/L)脅迫已對菜豆基因組DNA造成損傷,多態(tài)性譜帶中出現(xiàn)了條帶增加和缺失現(xiàn)象,基因組穩(wěn)定性降至69.6%;當(dāng)鎘濃度提高至80mg/L時(shí),基因組 DNA造成了大面積損傷,多態(tài)性譜帶幾乎全部消失,基因組穩(wěn)定性降至2.1%.

綜合生理和生化指標(biāo),本研究中低濃度鎘(20mg/L)脅迫就會造成菜豆幼苗的損傷,但因植物體內(nèi)本身也存在對重金屬毒性的抵抗和修復(fù)作用機(jī)制,此時(shí)植株可以維持正常的生理代謝過程,外在生理生長特性暫時(shí)沒有明顯的可見變化,但通過RAPD技術(shù)在基因組層面上則可以觀察到明顯的損傷,這種對遺傳物質(zhì)的直接損傷將影響正常的遺傳代謝.高濃度的鎘(80mg/L)脅迫則會導(dǎo)致植物體內(nèi)生理代謝系統(tǒng)的紊亂和遺傳系統(tǒng)的崩潰,從而導(dǎo)致植株死亡.有關(guān)鎘對菜豆幼苗DNA的損傷機(jī)制還有待進(jìn)一步研究.

4 結(jié)論

4.1 隨著鎘處理濃度的增加,菜豆幼苗生物量、還原型谷胱甘肽、脯氨酸及可溶性蛋白含量下降植株各器官中的鎘含量增加.

4.2 8條引物均產(chǎn)生了獨(dú)特的多態(tài)性條帶.對照組葉片基因組DNA的RAPD圖譜獲得46條譜帶.

4.3 與對照相比,鎘濃度處理下的 RAPD圖譜發(fā)生了改變,呈現(xiàn)譜帶強(qiáng)度增強(qiáng)或減弱、譜帶消失或新增.20,40mg/L鎘處理下出現(xiàn)新條帶分別為2和4條.隨鎘處理濃度增加,消失的條帶增多,尤其80mg/L處理下消失條帶達(dá)44條,可能與鎘處理引起的DNA構(gòu)象改變及多種損傷有關(guān).

4.4 RAPD分析技術(shù)可作為蔬菜等相關(guān)作物早期重金屬污染傷害的有效評價(jià)指標(biāo),可為輕度鎘污染區(qū)菜豆等蔬菜品種選育、鎘污染毒性評價(jià)提供依據(jù).

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