吳偉偉，隆小華，劉兆普，高影影，王長(zhǎng)海

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院江蘇省海洋生物學(xué)重點(diǎn)試驗(yàn)室，江蘇南京，210095)

三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)與扁藻(TetraselmisChui)是分別屬于羽紋硅藻(Pennate)和綠藻門(Chlorophyceae)的2種不同種類的海洋微藻，均具有適應(yīng)性強(qiáng)、易于培養(yǎng)和含油量高等特點(diǎn)，尤其是在生長(zhǎng)過(guò)程中其細(xì)胞內(nèi)可大量積累多種高不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFAs)［1］。

氮源對(duì)海洋微藻的生長(zhǎng)與脂肪酸合成過(guò)程具有重要的影響。為了進(jìn)一步提高三角褐指藻與扁藻的產(chǎn)脂肪酸能力，探討氮源對(duì)其生長(zhǎng)和生產(chǎn)脂肪酸能力的影響，本試驗(yàn)選取了NaNO3、NH4Cl和尿素等3種氮源，較詳細(xì)地研究其對(duì)三角褐指藻和扁藻生長(zhǎng)、葉綠素含量、可溶性糖、可溶性蛋白、細(xì)胞干重及總脂的影響，著重分析了不同氮源對(duì)2種微藻脂肪酸組成及含量的影響，為進(jìn)一步確定2株微藻的最適氮源和氮源利用方式提供基礎(chǔ)［2］。

1 材料與方法

1.1 藻種

三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、扁藻(TetraselmisChui)，藻種購(gòu)自中科院青島海洋研究所微藻種質(zhì)庫(kù)，經(jīng)江蘇省海洋生物學(xué)重點(diǎn)試驗(yàn)室分離純化后備用。

1.2 培養(yǎng)條件

試驗(yàn)采用人工海水(稱取31 g的海鹽，溶于1 L蒸餾水中，配制成鹽度為3.1%的人工海水)，經(jīng)脫脂棉過(guò)濾，高溫高壓滅菌20 min，并分別以 NaNO3、尿素、NH4Cl為氮源的F/2作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。試驗(yàn)在500 mL三角瓶中進(jìn)行，培養(yǎng)體積為250 mL，每個(gè)處理3個(gè)平行組。培養(yǎng)溫度為(20±1)℃，光暗比為14∶10(光照強(qiáng)度為2500 lx)。每天定時(shí)搖瓶2～3次，隨機(jī)變換三角瓶的位置。

1.3 微藻生物量的測(cè)定與收獲

分別利用顯微鏡計(jì)數(shù)和分光光度計(jì)測(cè)定微藻細(xì)胞個(gè)數(shù)與培養(yǎng)液的吸光值，依據(jù)多天的測(cè)定結(jié)果得出2株微藻生物量(細(xì)胞密度)與吸光值之間的線性關(guān)系。微藻的相對(duì)生長(zhǎng)速率計(jì)算:

其中，N0是起始時(shí)藻液的吸光值;Nt是收獲時(shí)藻液的吸光值［3］。

在指數(shù)生長(zhǎng)期末期，利用超速冷凍離心機(jī)5 000 r/min離心15 min收集藻液，冷凍干燥，將得到的藻粉置于超低溫冰箱中保存，以備測(cè)脂肪酸。

1.4 葉綠素測(cè)定

取相同體積指數(shù)生長(zhǎng)末期的藻液，利用超速冷凍離心機(jī)于5 000 r/min離心15 min后加入等體積丙酮，黑暗條件下放置24 h，后于4 000 r/min下離心10 min，取上清液于645 nm和663 nm測(cè)OD值，計(jì)算葉綠素質(zhì)量濃度(mg/L)［4］。

1.5 可溶性糖和可溶性蛋白測(cè)定

可溶性糖含量采用蒽酮比色法［5］;可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定［5］。

1.6 干重

取一定體積指數(shù)生長(zhǎng)末期的藻液，利用超速冷凍離心機(jī)，5 000 r/min離心15 min，棄上清液，后經(jīng)冷凍干燥稱重。

1.7 總脂

經(jīng)冷凍干燥后的藻液，采用Bligh＆dyer的方法提取脂質(zhì)［6－7］;后經(jīng)真空蒸發(fā)后計(jì)算粗脂肪的含量［6］。

1.8 脂肪酸組成的氣相色譜分析

向提取得到的脂質(zhì)中加入1～2 mL的0.4 mol/L KOH-CH3OH溶液，40℃水浴10 min后加入2 mL正己烷，再將樣品轉(zhuǎn)移至10 mL具塞量筒中，加水至頂端，振蕩后靜置至溶液分層，取上層有機(jī)相進(jìn)行氣相色譜分析［8］。采用Agilent7890氣相色譜儀，氫火焰離子化檢測(cè)器，HP-5柱子，升溫程序:170℃保持5 min，以5℃/min升至250℃，保持10 min。進(jìn)樣口，檢測(cè)器的溫度為250℃。載氣為高純度氮?dú)猓魉贋?0 mL/min，進(jìn)樣量1 μL。脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品為Simga 公司產(chǎn)品［6，8］。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用Excel 2003和SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮源對(duì)三角褐指藻和扁藻生長(zhǎng)的影響

對(duì)2株微藻細(xì)胞密度與吸光值之間進(jìn)行回歸分析，得到二者的線性關(guān)系式，三角褐指藻為:Y=117.82×104X+529.25×104(R2=0.998 6)，其中X為藻液吸光值A(chǔ)656，Y為藻細(xì)胞密度;扁藻為:Y=161.85×104X－105.24×104(R2=0.997 9)，其中X為藻液吸光值A(chǔ)682，Y為藻細(xì)胞密度。可見，在本試驗(yàn)范圍內(nèi)，三角褐指藻及扁藻的細(xì)胞密度與吸光值均呈線性相關(guān)，可利用藻液的吸光值表示微藻的生長(zhǎng)情況。

3種氮源對(duì)三角褐指藻相對(duì)生長(zhǎng)速率的影響依次為:尿素＞NaNO3＞NH4Cl，且差異性顯著;其中尿素對(duì)三角褐指藻生長(zhǎng)的影響最大，生物量最高(圖1)。

3種氮源對(duì)扁藻相對(duì)生長(zhǎng)速率的影響依次為:NH4Cl＞尿素＞NaNO3;即NH4Cl對(duì)扁藻生長(zhǎng)的影響最大，但是彼此間的差異性不顯著(圖2)。

圖1 不同氮源對(duì)三角褐指藻吸光值(A)和相對(duì)生長(zhǎng)速率(B)的影響

圖2 不同氮源對(duì)扁藻吸光值(A)和相對(duì)生長(zhǎng)速率(B)的影響

2.2 氮源對(duì)三角褐指藻和扁藻葉綠素含量的影響

從圖3可知，氮源對(duì)2株海洋微藻葉綠素含量影響差異性顯著。尿素為氮源時(shí)，三角褐指藻的葉綠素含量達(dá)到最大，依次為NaNO3，NH4Cl;其葉綠素含量分別下降了22.7%和43.0%(圖3)。扁藻以NH4Cl為氮源時(shí)，獲得最大的葉綠素含量，依次為尿素，NaNO3;其葉綠素含量分別下降了5.1%和11.5%(圖4)。

圖3 不同氮源對(duì)三角褐指藻葉綠素含量影響

2.3 氮源對(duì)三角褐指藻和扁藻可溶性糖、可溶性蛋白含量的影響

從圖5可知，尿素為氮源時(shí)，三角褐指藻的可溶性糖含量達(dá)到最大，依次為NaNO3，NH4Cl;其可溶性糖含量分別下降了3.3%和6.0%，且差異性顯著(圖5A)。尿素為氮源時(shí)，三角褐指藻可溶性蛋白含量達(dá)到最大，依次為NH4Cl，NaNO3;其可溶性蛋白含量分別下降了2.9%和21.3%。尿素與NH4Cl為氮源時(shí)，對(duì)三角褐指藻可溶性蛋白含量影響差異不顯著(圖5B)。

圖4 不同氮源對(duì)扁藻葉綠素含量的影響

圖5 不同氮源對(duì)三角褐指藻可溶性糖(A)和可溶性蛋白(B)含量的影響

圖6 不同氮源對(duì)扁藻可溶性糖(A)和可溶性蛋白(B)含量的影響

從圖6可知，NH4Cl為氮源時(shí)，扁藻的可溶性糖和可溶性蛋白含量均達(dá)到最大，依次為尿素和NaNO3;其可溶性糖分別下降了17.6%和26.8%，可溶性蛋白分別下降了1.5%和3.8%。氮源對(duì)扁藻可溶性糖及可溶性蛋白含量的影響差異性均顯著。

2.4 氮源對(duì)三角褐指藻和扁藻干重、總脂含量的影響

以尿素為氮源，三角褐指藻的干重達(dá)到了最大量，為 1.21 g/L，其次為 NaNO3，NH4Cl，其干重分別下降了5.0%和10.0%(圖7A)。NH4Cl為氮源的時(shí)候，三角褐指藻的總脂達(dá)到了最大量，為47.5%，其次為NaNO3，尿素，分別下降了27.7%，36.2%，且差異性顯著(圖7B)。

NH4Cl為氮源的時(shí)候，扁藻的干重達(dá)到了最大量，為0.89 g/L，依次為尿素，NaNO3;其干重分別下降了21.3%和30.3%(圖8A)。NaNO3為氮源的時(shí)候，扁藻的總脂達(dá)到了最大量為 38.5%，依次為 NH4Cl，尿素，但差異性不顯著(圖8B)。

圖7 不同氮源對(duì)三角褐指藻干重(A)和總脂(B)的影響

圖8 不同氮源對(duì)扁藻干重(A)和總脂(B)的影響

2.5 氮源對(duì)三角褐指藻和扁藻脂肪酸組成與含量的影響

氣相色譜數(shù)據(jù)分析表明，以尿素為氮源時(shí)，三角褐指藻的脂肪酸種類增多，但脂肪酸總量減少。3種氮源培養(yǎng)條件下，三角褐指藻的總單不飽和脂肪酸(TMUFA)含量均大于飽和脂肪酸(TSFA)和多不飽和脂肪酸含量(TPUFA)。NH4Cl為氮源時(shí)，三角褐指藻總脂肪酸的百分比達(dá)到最大，為39.59%，且TMUFA﹥TSFA﹥TPUFA，占總脂肪酸的百分比分別為:17.64%、12.10%、9.85%。以 NaNO3為氮源時(shí)，其總脂肪酸的百分比為21.57%，且TMUFA﹥TSFA﹥TPUFA，占總脂肪酸的11.59%、8.41%、1.57%。以尿素為氮源時(shí)，其總脂肪酸的百分比為15.28%，且TMUFA﹥TPUFA﹥TSFA，占總脂肪酸的百分比依次為12.69%、2.47%、0.12%。

NaNO3為氮源時(shí)，扁藻的脂肪酸種類及總量均增多，其總脂肪酸的百分比達(dá)到最大為20.82%，且TPUFA﹥TSFA﹥TMUFA，占總脂肪酸的百分比依次為10.41%、5.45%、4.96%。以NH4Cl為氮源時(shí)，其總脂肪酸的百分比為5.62%，且TSFA﹥TMUFA﹥TPUFA，占總脂肪酸的百分比依次為2.31%、2.29%、1.02%。以尿素為氮源時(shí)，其總脂肪酸的百分比為3.77%，且TMUFA﹥ TPUFA﹥ TSFA，占總脂肪酸的百分比依次為1.73%、1.39%、0.65%。氮源對(duì)不同微藻的脂肪酸組成影響不一致。

3 討論

通常情況下微藻可以利用的氮源有銨鹽、硝酸鹽及尿素等，但在吸收速度與利用程度上卻存在一定差異，且不同氮源對(duì)于微藻各項(xiàng)生理指標(biāo)的影響也不同［9－10］。國(guó)內(nèi)外關(guān)于氮源對(duì)微藻各項(xiàng)指標(biāo)的影響意見并不一致，Ohmori［11］和 Guerrero［12］等先后報(bào)道了藍(lán)藻、藍(lán)綠藻對(duì)氨氮的吸收利用優(yōu)于其它形式的氮源，認(rèn)為微藻可以直接以NH+4作為合成氨基酸的原料;潘庭雙等［13］發(fā)現(xiàn)，微綠球藻以尿素和 NaNO3作氮源效果最好，NH4Cl效果較差;王順昌［14］等認(rèn)為尿素對(duì)蛋白核小球藻生長(zhǎng)、色素積累的效果優(yōu)于氨態(tài)氮和硝酸態(tài)氮，硝酸態(tài)氮在中性脂肪積累上優(yōu)于尿素氮和氨態(tài)氮。本實(shí)驗(yàn)表明:三角褐指藻以尿素為氮源時(shí)生長(zhǎng)最快;扁藻以NH4Cl為氮源時(shí)生長(zhǎng)最快。這是因?yàn)槿呛种冈寮?xì)胞內(nèi)具有尿素酶，使尿素可以更好的被吸收同化，且尿素不改變培養(yǎng)液的酸堿反應(yīng)，可以保持pH值的穩(wěn)定更利于微藻的生長(zhǎng);而扁藻細(xì)胞內(nèi)可能不具有尿素酶。這說(shuō)明不同微藻對(duì)不同形式氮鹽喜好和利用能力存在差異。

微藻的色素積累受多種環(huán)境因素的影響，如光照、溫度等，其中氮源也是影響色素積累的因素之一，當(dāng)培養(yǎng)液中氮源不足時(shí)，會(huì)導(dǎo)致葉綠素含量的降低［15］。我們的研究表明，三角褐指藻以尿素為氮源時(shí)葉綠素積累量達(dá)到最大;扁藻以NH4Cl為氮源時(shí)葉綠素積累量達(dá)最大，且3種氮源對(duì)兩種海洋微藻葉綠素積累的影響差異性顯著。這與氮源對(duì)微藻生長(zhǎng)的影響結(jié)果一致。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，三角褐指藻以尿素為氮源時(shí)可溶性糖、可溶性蛋白含量達(dá)到最大，以NH4Cl為氮源時(shí)總脂含量達(dá)到最大。扁藻以NH4Cl為氮源時(shí)可溶性糖、可溶性蛋白含量達(dá)到最大;以NaNO3為氮源時(shí)總脂含量達(dá)到最大。由于糖、蛋白質(zhì)對(duì)微藻生長(zhǎng)至關(guān)重要，其要增殖必須積累糖類和蛋白質(zhì)，相對(duì)而言總脂的合成量會(huì)降低。

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