張艷英，肖冬光，張翠英，王文陽，汪東升，李月強

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津，300457)

白酒是中國特有的蒸餾酒，風味獨特，深受人們喜愛。高級醇類物質是形成白酒風味的重要物質之一，若含量適宜，可使白酒口感柔和豐滿、味道獨特;但如果含量過高，會使白酒產生異雜味，影響酒的風味和品質，并且飲用后易上頭，危害身體健康;反之，高級醇含量不足，酒味將變得稀薄單調。因此，必須控制白酒中高級醇的含量。而我國目前以玉米等蛋白質含量豐富的原料發(fā)酵生產的白酒中高級醇含量較高，發(fā)酵結束后總含量通常在300 mg/L(或300 mg/kg，以異丁醇和異戊醇計)以上。

釀酒酵母酒精發(fā)酵過程中，高級醇主要有兩條形成途徑，分別為氨基酸分解代謝途徑(Ehrlich途徑)［1］和糖代謝合成途徑［2］。BAT2 是控制酵母細胞質中氨基酸轉氨酶的編碼基因，本實驗室前期通過同源重組構建了BAT2缺失單倍體突變株A8-B和C22-B，但其染色體上帶有G418抗性基因KanMX且酵母單倍體突變株不穩(wěn)定，不能應用到工業(yè)生產中，因此必須去除A8-B和C22-B基因組上的G418抗性基因KanMX，并且將它們雜交成雙倍體，構建優(yōu)良的低產高級醇基因工程安全菌株。

大腸桿菌P1噬菌體Cre基因的38.5ku產物(該產物是一種重組酶 ，recombinase)能識別并催化loxP位點間的重組;loxP位點含34bp，包括被8bp間隔的2個13bp反向重復，每個反向重復及其臨近的4bp 構成一個 Cre 蛋白的結合區(qū)［3－4］。Hegemann［5］等人構建了loxP-Marker-loxP系列基因敲除體系，通過PCR反應將loxP-Marker-loxP基因片段從模板質粒pUG6擴增出來，同時在兩端帶上擬敲除基因約50bp的同源區(qū)，此基因片段進入酵母后與擬敲除基因發(fā)生同源重組，根據G418抗性篩選出陽性克隆。然后將帶有Cre重組酶的質粒導入陽性轉化子，通過半乳糖的誘導表達將兩個loxP位點間的抗性基因去除。文獻［6－7］就是利用Cre/loxp系統(tǒng)實現loxP位點間目的片段的精確去除。

本文以2株BAT2缺失單倍體突變株為出發(fā)菌株，利用重組質粒pGAPZA中的Cre重組酶編碼基因去除G418抗性基因KanMX，然后將這2株單倍體雜交成雙倍體菌株ΔBAT2，該菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性，以野生菌株和出發(fā)菌株為對照，通過白酒發(fā)酵試驗測定了其主要發(fā)酵指標。

1 材料與方法

1.1 菌株

大腸桿菌(Escherichia coli)JM109、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AY15及其生孢子得到的單倍體菌株A8和C22、BAT2缺失單倍體突變株A8-B和C22-B及質粒pGAPZA(帶有Zeocin抗性和Cre重組酶基因)均為本實驗室保存。

1.2 主要儀器

電熱恒溫水浴鍋，電子天平，臺式高速離心機，生化培養(yǎng)箱，HS-1300-V型超凈臺，恒溫搖床，光學顯微鏡，全自動凝膠成像儀，GL20A型高速冷凍離心機，PCT-200型PCR基因擴增儀，P型移液器，DYY-4c型電泳儀，AgilentGC 7890，DL102x型電熱鼓風干燥箱。

1.3 主要培養(yǎng)基

YEPD培養(yǎng)基，YPG誘導培養(yǎng)基(將YEPD培養(yǎng)基中葡萄糖改為半乳糖)，LB培養(yǎng)基，棉子糖生孢培養(yǎng)基［8］

1.4 實驗方法

1.4.1 引物

利用Primer5.0設計PCR反應引物(表1)。

表1 本文所用引物

1.4.2 酵母轉化

利用醋酸鋰轉化法［9］將pGAPZA質粒轉入A8-B和C22-B中，提取酵母質粒，PCR擴增驗證pGAPZA質粒是否轉入A8-B和C22-B中。

1.4.3 G418抗性基因的去除

已攜帶有pGAPZA質粒的A8-B和C22-B在半乳糖培養(yǎng)基中誘導表達4～5 h，稀釋涂布，挑出單菌落于YEPD平板上，再影印到G418抗性平板上，30℃靜置培養(yǎng)48 h。在YEPD上生長而在G418抗性平板上不生長即為所得到的菌株。提取酵母基因組，PCR擴增驗證KanMX基因是否去除。

1.4.4 質粒pGAPZA的丟失

將帶有質粒pGAPZA的酵母菌株接入10 mL YEPD液體培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)12 h。按1∶100的接種量，接到新的10 mL YEPD培養(yǎng)基中，同樣條件下培養(yǎng)12 h，如此反復，直至pGAPZA質粒丟失。取適量每次傳代的菌液稀釋涂布于YEPD平板上，挑取單菌落于5 mL YEPD中，培養(yǎng)12 h，提取酵母質粒，PCR驗證pGAPZA質粒是否丟失。

1.4.5 單倍體雜交

將單倍體菌株按照吳帥等所述方法［10］雜交成雙倍體，提取其基因組，PCR驗證BAT2缺失且無G418抗性基因。

1.4.6 雙倍體的遺傳穩(wěn)定性

從斜面上挑取1環(huán)雙倍體ΔBAT2于5 mL YEPD培養(yǎng)基中，每隔12 h轉接1次，如此反復轉接20次以上，對第 1、5、10、15、20 次的雙倍體進行 PCR 驗證。

1.5 分析方法

1.5.1 CO2失重的測定

接種二級種子于玉米糊培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)，按照文獻［11］描述的方法每隔12 h測CO2失重。

1.5.2 還原糖的測定

斐林試劑法［11］。

1.5.3 酒精度的測定

酒精計比重法［11］。

1.5.4 高級醇測定方法［12－13］

發(fā)酵結束后蒸餾發(fā)酵液得到含有高級醇的待測樣品。本試驗測定高級醇的最佳條件為:色譜柱Agilent1909N －213:260℃;30 m ×320 μm ×0.5 μm;柱溫55℃保持5 min，然后以15℃/min的速度升溫至100℃，再保持6 min;進樣口溫度230℃;檢測器溫度250℃;載氣流速1.000 mL/min保持5 min，然后以1.000 mL/min的速度升至5.000 mL/min，再保持1 min;氫氣流速30 mL/min;空氣流速400 mL/min;尾吹速度 25 mL/min;分流比 20∶1;進樣量 1 μL。

2 結果與分析

2.1 G418抗性基因的去除

2.1.1 pGAPZA質粒轉化突變株A8-B和C22-B

將質粒 pGAPZA分別轉化 A8-B和 C22-B，在Zeocin抗性平板上挑轉化子，提取酵母質粒，通過PCR驗證篩選出帶有pGAPZA質粒的菌株，PCR結果如圖1所示。

由圖1可知pGAPZA質粒上存在大小為1100bp的Cre基因和1200bp的 Zeocin抗性基因;未攜帶pGAPZA質粒的A8-B和C22-B酵母質粒上不存在Cre基因和Zeocin抗性基因;攜帶pGAPZA質粒的A8-B和C22-B酵母質粒上PCR擴增的Cre基因和Zeocin抗性基因片段與陽性對照pGAPZA質粒上擴增到的片段大小一致。這些結果證明pGAPZA質粒已成功轉入釀酒酵母A8-B和C22-B中。

反映其成礦是在基性火山熔巖噴發(fā)間歇期沉積形成，其圍巖為基性火山巖(斜長角閃巖)。說明其成礦物質來源除部分來自陸源外，大部分與其中火山沉積建造有關。

圖1 攜帶pGAPZA質粒的釀酒酵母A8-B和C22-B的PCR驗證

2.1.2 單倍體菌株ΔBAT2a和ΔBAT2α的獲得

半乳糖培養(yǎng)基誘導已攜帶pGAPZA質粒的A8-B和C22-B，利用影印平板法篩選出YEPD平板上生長而G418平板上不生長的菌株，分別命名為ΔBAT2a和ΔBAT2α，并通過PCR驗證G418抗性基因是否去除，結果如圖2所示。

圖2 KanMX基因去除的PCR驗證

由圖2可知，A8和C22基因組上存在完整的BAT2基因，PCR擴增的BA-BAT2-BB片段大小為2100bp;BAT2缺失突變株A8-B和C22-B基因組上BAT2基因被抗性基因KanMX替代，PCR擴增得到2600bp的BA-KanMX-BB重組盒和1 600bp的KanMX基因;ΔBAT2a和 ΔBAT2α 基因組上去除KanMX基因后PCR擴增得到1100bp的BA-BB片段。這些結果證明已成功獲得了無G418抗性基因的菌株 ΔBAT2a和 ΔBAT2α。

2.1.3 pGAPZA質粒的丟失

在YEPD培養(yǎng)基上連續(xù)傳代 ΔBAT2a和ΔBAT2α，PCR驗證pGAPZA質粒是否丟失，結果如圖3所示。

圖3 pGAPZA質粒丟失PCR驗證

由圖3可知，從ΔBAT2a和ΔBAT2α酵母質粒上擴增不到Zeocin抗性基因片段，證明pGAPZA質粒已丟失。

2.2 單倍體ΔBAT2a和ΔBAT2α的雜交

將單倍體 ΔBAT2a和 ΔBAT2α 進行雜交(圖4 A)，獲得雙倍體菌株ΔBAT2，并進行生孢驗證(圖4 B)。提取雙倍體菌株ΔBAT2的基因組，以BA-U和BB-D為引物進行 PCR擴增，結果如圖2泳道5(略)。

圖4 A，單倍體ΔBAT2a和ΔBAT2α的融合;B，雙倍體ΔBAT2的生孢驗證

2.3 雙倍體的遺傳穩(wěn)定性

提取第1、5、10、15、20 次轉接的 ΔBAT2 的基因組，以BA-U和BB-D為引物進行PCR擴增，結果得到大小為1 100bp的BA-BB片段，如圖2第5個泳道(略)，這就證明了單倍體ΔBAT2a和ΔBAT2α雜交的雙倍體ΔBAT2具有很好的遺傳穩(wěn)定性。

2.4 發(fā)酵試驗

將野生菌株、出發(fā)菌株與BAT2缺失且無G418抗性基因的ΔBAT2同時進行白酒發(fā)酵試驗，發(fā)酵結束后測定菌株的主要發(fā)酵指標(表2)。

表2 菌株主要發(fā)酵指標

由表2可以看出，BAT2缺失且無G418抗性基因的ΔBAT2與出發(fā)菌株A8-B和C22-B相比，CO2失重高，殘?zhí)堑?，乙醇含量?野生菌株AY15的異丁醇、異戊醇、總高級醇含量分別為 8.60 mg/100 mL、20.81 mg/100 mL、33.89 mg/100 mL，突變株 ΔBAT2的異丁醇、異戊醇、總高級醇含量分別為4.30 mg/100 mL、13.86 mg/100 mL、23.53 mg/100 mL，分別比野生菌株AY15降低50.00%、33.40%、30.57%。

3 討論

高級醇是白酒中重要的風味物質之一，但是其含量超過一定量又會影響到白酒風味。在酵母菌發(fā)酵過程中，高級醇主要有兩條代謝途徑，一是氨基酸轉氨途徑(Ehrlich代謝途徑)，另一是糖代謝途徑(Harris途徑)，分別由 BAT基因編碼的氨基酸轉氨酶［14－15］和YDL080C基因編碼的類丙酮酸脫羧酶調控［16］。本實驗室前期敲除了野生菌株AY15的單倍體A8和C22基因組上的YDL080C基因，但獲得的突變菌株生成的異丁醇、異戊醇及總高級醇與野生菌株相比沒有明顯變化［17］;因此又構建了氨基酸分解代謝途徑中細胞質氨基酸轉氨酶的編碼基因BAT2完全缺失的突變株A8-B和C22-B［18］，但突變株染色體上帶有G418抗性基因KanMX且單倍體突變株不穩(wěn)定，不能進行工業(yè)生產，因此必須去除抗性基因KanMX并將其雜交成雙倍體，構建優(yōu)良的低產高級醇基因工程安全菌株。

本實驗通過Cre/loxp系統(tǒng)去除BAT2完全缺失的突變株A8-B和C22-B染色體上的G418抗性基因KanMX，并將其雜交為雙倍體ΔBAT2，且雙倍體具有良好的遺傳穩(wěn)定性。白酒發(fā)酵試驗結果顯示，構建的基因工程安全菌株ΔBAT2與出發(fā)菌株A8-B和C22-B相比，CO2失重高，殘?zhí)堑?，乙醇含量?與野生菌株AY15相比，高級醇明顯降低。ΔBAT2生成的異丁醇、異戊醇、總高級醇分別為4.30 mg/100 mL、13.86 mg/100 mL、23.53 mg/100 mL，比野生菌株分別降低了50.00%、33.40%、30.57%。

基因工程安全菌株ΔBAT2的構建不僅實現了低產高級醇，而且去除了G418抗性基因，具有雙倍體的遺傳穩(wěn)定性，可直接用于白酒工業(yè)生產，這個實驗成果對改善白酒品質，提高我國釀酒工業(yè)的生產技術水平和國際競爭力具有重要意義。

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