馮以明, 李廣生, 吳建東, 王培培, 趙 峽, 于廣利

(1. 海洋藥物(中國海洋大學(xué))教育部重點(diǎn)實(shí)驗室, 山東青島 266003; 2. 山東省糖科學(xué)與糖工程重點(diǎn)實(shí)驗室,山東青島 266003)

雨生紅球藻多糖的提取分離及理化性質(zhì)研究

馮以明1,2, 李廣生1,2, 吳建東1,2, 王培培1,2, 趙 峽1,2, 于廣利1,2

(1. 海洋藥物(中國海洋大學(xué))教育部重點(diǎn)實(shí)驗室, 山東青島 266003; 2. 山東省糖科學(xué)與糖工程重點(diǎn)實(shí)驗室,山東青島 266003)

將雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)經(jīng)乙醇/乙酸乙酯(1：2,V/V)脫脂, 通過冷水、熱水和5%碳酸鈉提取, 得到 3種粗多糖(HPC、HPH和HPA), 通過 Q-Sepharose FF陰離子交換柱進(jìn)一步分級, 從HPC中得到HPC1、HPC2和HPC3共3種多糖組分。運(yùn)用高效液相色譜法(HPLC)、紅外光譜(IR)等方法對其單糖組成、相對分子質(zhì)量和基本結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析比較。結(jié)果表明, 各組分單糖組成復(fù)雜, 主要含有半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、阿拉伯糖(Ara)、葡萄糖(Glc)、葡萄糖醛酸(GlcUA)、半乳糖醛酸(GalUA)、木糖(Xyl)、鼠李糖(Rha)、巖藻糖(Fuc)、葡萄糖胺(GlcN)和半乳糖胺(GalN), 其中, Gal含量最高, 大于20%。多糖HPC1、HPC2和HPC3的相對峰位分子質(zhì)量分別為502.6, 373.2, 577.5和300.5 ku。

雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis); 多糖; 理化性質(zhì); 單糖組成

雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)是一種在淡水中生長的單細(xì)胞綠藻, 分類學(xué)上屬于綠藻門、綠藻綱、團(tuán)藻目、紅球藻科、紅球藻屬。它在弱光和氮磷豐富的環(huán)境中以游動的綠色營養(yǎng)細(xì)胞存在, 而在不利生存的條件下, 則以厚壁的不動細(xì)胞存在,同時在細(xì)胞內(nèi)積累大量的蝦青素而呈紅色[1]。目前,對該藻成分的研究多集中于蝦青素的研究應(yīng)用, 而對其多糖的相關(guān)研究未見報道。

本文以雨生紅球藻粉為原料, 將其脫脂后, 采用不同提取方法獲得不同種類多糖, 并對其理化性質(zhì)和單糖組成進(jìn)行分析, 為其多糖資源的研究利用提供基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗材料與方法

1.1 材料與儀器

雨生紅球藻藻粉(Haematococcus pluvialis), 購于美國Cyanotech公司。葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品(11.8、47.3、112、212、788 ku)購于日本Shodex公司; 單糖標(biāo)準(zhǔn)品(Glc, Man, Gal, Fuc, Rha, GlcN, GalN, Xyl, Arb,GlcUA, GalUA)、標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP, 99%)購于美國Sigma公司; 氯仿,甲醇等其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

強(qiáng)陰離子交換樹脂(Q-Sepharose Fast Flow,90 μm, 美國GE Healthcare公司); 高效凝膠色譜柱(PL aquagel-OH mixed, 30 cm×7.5 mm×8 μm, 美國Perkin Elmer公司); Eclipse XDB-C18 色譜柱(4.6 mm×150 mm, 5 μm, 美國 Agilent公司); 高效液相色譜儀(LC-20AD, 日本島津公司); 紅外光譜儀(Nicolet Nexus 470型, Thermo Electron公司); 紫外可見分光光度計(UV-2102 PCS, 尤尼柯(上海)儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 多糖的提取分離[2]

雨生紅球藻藻粉經(jīng)乙醇/乙酸乙酯(1：2,V/V)脫脂3次[3], 收集殘渣并于40 ℃烘干備用。取脫脂藻粉,加入30倍體積蒸餾水, 室溫攪拌提取3 h后離心收集上清液。重復(fù)提取 2次合并上清液。將上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后, 加入4倍體積95%乙醇, 離心取沉淀,經(jīng)丙酮脫水并45 ℃干燥, 得冷水提粗多糖HPC。冷水提取后的藻渣, 加入30倍體積蒸餾水, 85 ℃攪拌提取3 h后離心收集上清液。重復(fù)提取2次。合并上清液并濃縮, 加入4倍體積95%乙醇。離心收集沉淀,經(jīng)脫水并干燥, 得熱水提多糖 HPH。熱水提取后的藻渣, 加入20倍體積5%碳酸鈉, 80℃攪拌提取1.5 h后離心收集上清液。重復(fù)提取 2次。合并的上清液用4 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至 7～8。濃縮上清液, 加入4倍體積 95%乙醇。離心收集沉淀, 經(jīng)脫水和干燥,得堿提多糖HPA。將3種多糖樣品用蒸餾水溶解后,透析(MWCO 7kD)2 d, 至透析外液的電導(dǎo)與蒸餾水相同。各組分溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮, 干燥, 稱重。提取流程見圖1。

得到的多糖組分HPC經(jīng)Q-Sepharose Fast Flow強(qiáng)陰離子交換色譜柱(XK 3.5/10,V=150 mL)分離純化[4]。采用0、0.2和0.4 mol/L NaCl梯度洗脫2個柱體積(流速3 mL /min, 15mL/管), 硫酸苯酚法[5]檢測,合并各組分, 經(jīng)透析脫鹽干燥后, 得 HPC1、HPC2和HPC3共3種多糖組分。

圖1 雨生紅球藻多糖的提取分離流程圖Fig. 1 Extraction and separation flow chart of polysaccharides from Haematococcus pluvialis

1.2.2 理化性質(zhì)分析

總糖含量以半乳糖為標(biāo)準(zhǔn)品采用硫酸苯酚法[5];硫酸基含量采用硫酸鋇-明膠比濁法[6]; 粗蛋白含量采用 Folin-酚比色法[7]; 糖醛酸含量采用改良的咔唑法[8]。

1.2.3 分子質(zhì)量測定及純度測定[9]

色譜條件：色譜柱(PL aquagel-OH mixed, 8 μm,30 cm × 7.5 mm); 流動相為 0.2 mol/L NaNO3溶液(含10 mol/L NaH2PO4, pH 7.0), 流速為 0.5 mL/min,柱溫為30℃; 進(jìn)樣量10 μL; 示差檢測器。以標(biāo)準(zhǔn)多糖分子量的對數(shù)(lgMW)對保留時間(tR)作圖, 得標(biāo)準(zhǔn)曲線為lgMW= 30.401-3.0775tR,R2=0.996。

1.2.4 單糖組成分析[2,10]

采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生高效液相色譜(PMP-HPLC)法測定單糖組成。樣品的準(zhǔn)備：取多糖樣品各2 mg于安瓿瓶, 加入2 mol/L三氟乙酸(TFA)1 mL, 封口, 105℃水解6 h。水解液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干, 得完全酸水解單糖樣品。色譜條件：Eclipse XDB-C18 色譜柱(4.6 mm × 150 mm, 5 μm); 流動相為含磷酸鹽緩沖液和乙腈的混合溶液(83：17,V/V),流速為 1.0 mL/min, 柱溫 25℃; 進(jìn)樣量 20 μL;245 nm檢測。

1.2.5 醋酸纖維薄膜電泳

將醋酸纖維素薄膜放入50%甲醇溶液浸泡過夜,電泳前用濾紙吸去其表面的甲醇溶液, 置于電泳緩沖液中浸泡約 20 min。用濾紙吸去薄膜表面的電泳緩沖液, 分別吸取10 μL標(biāo)準(zhǔn)品和樣品溶液于超級加樣器孔中, 用加樣器點(diǎn)樣(0.5 μL) , 將薄膜置于電泳槽中平衡10 min。采用醋酸鋇電泳緩沖液, 在如下條件進(jìn)行電泳：0.05 mol/L醋酸鋇(pH 5.0), 電流7 mA,電泳時間45 min電泳結(jié)束后用0.5%(W/V)阿利新藍(lán)染色約20 min, 以2%醋酸溶液脫色。

1.2.6 紅外光譜分析

樣品用P2O5干燥48 h, 取1～2 mg經(jīng)KBr壓片,測定紅外光譜, 掃描范圍為400～4000 cm-1。

2 結(jié)果與討論

2.1 理化性質(zhì)分析

雨生紅球藻富含蝦青素, 是一種非VA源類胡蘿卜素, 具有親脂性, 易溶于有機(jī)溶劑。根據(jù)文獻(xiàn)[3],提取溶劑采用乙醇與乙酸乙酯的混合液(1：2,V/V),該藻含脂類物質(zhì)30.7%。3個粗多糖組分性狀均為褐色粉末, 得率均不高, 分別為 2.74%、1.36%及1.55%。HPC的總糖含量最高(69.8%)而蛋白含量最低(10.9%); HPA的總糖含量最低(33.2%)而蛋白含量最高(23.5%); 3種粗多糖的硫酸基含量和糖醛酸含量均較低(4%左右), 該特點(diǎn)與海洋藻中多糖不同, 這與其生長環(huán)境鹽度低有關(guān)。

由于 3種粗多糖的單糖組成結(jié)果相近, 無明顯區(qū)別, 故選取得率較高的粗多糖HPC過QFF強(qiáng)陰離子交換柱梯度洗脫分離, 見圖2。從圖2中可知, 樣品HPC經(jīng)0、0.2和0.4 mol/L NaCl梯度洗脫后, 得到3個峰(分別命名為HPC1、HPC2和HPC3)。HPC1為淡黃色粉末, HPC2和HPC3為淡褐色粉末。HPC1的總糖含量最高(84.2%), HPC3的糖醛酸含量較高(14.0%)。粗多糖和純化后多糖的理化性質(zhì)如表1。

表1 雨生紅球藻中多糖的基本理化性質(zhì)比較Tab. 1 The physicochemical characters comparison of polysaccharides

2.2 單糖組成分析

圖2 雨生紅球藻多糖Q-Sepharose FF色譜分離圖Fig. 2 Segment elution graph of crude polysaccharide by Q-sepharose fast-flow column

根據(jù)文獻(xiàn)[10], PMP柱前衍生HPLC法適合于同時分離中性、酸性和堿性單糖, 該法反應(yīng)條件溫和且不產(chǎn)生立體異構(gòu), 各單糖衍生物在245 nm處有最大吸收, 故本實(shí)驗采用 PMP-HPLC法進(jìn)行分析。各純化組分的單糖組成分析譜圖見圖3, 單糖摩爾百分比及相對分子質(zhì)量見表2。從圖表中可以看出, 不同工藝提取的多糖的單糖種類多, 不僅有中性糖六碳糖Gal、Man、Glc和五碳糖Ara和Xyl, 而且有糖醛酸GlcUA、GalUA, 及其甲基糖Rha、Fuc, 還有氨基糖GlcN 和GalN。HPC1的Man和Ara含量接近20%,HPC2和HPC3的Glc含量為18%左右。HPC3的糖醛酸含量(GlcUA為 8.4%和 GalUA為 1.7%)和 Fuc含量(11.4%)相對較高, 這與其在QFF柱的洗脫順序相符。HPC1和HPC2在Man后出現(xiàn)了一個未知峰(峰12), 此物質(zhì)有待進(jìn)一步研究。

圖3 雨生紅球藻中3種多糖的單糖分析譜圖Fig. 3 The monosaccharides analysis of three kinds of polysaccharides

表2 3種多糖的主要單糖組成及其相對摩爾比Tab. 2 The monosaccharides composition and relative molar ratio analysis of three polysaccharides

2.3 醋酸纖維素薄膜電泳純度分析

采用醋酸纖維素薄膜電泳對粗多糖HPC以及純化后多糖HPC1、HPC2和HPC3進(jìn)行純度分析(圖4)。HPC1為水洗組分, 不被帶正電荷的阿利新藍(lán)染色,表明其屬于中性多糖, 該結(jié)果與單糖組成分析和 IR分析一致; HPC2同粗品HPC類似, 有一個主要多糖組分; 而HPC3至少有3個酸性多糖組分, 表明其分子結(jié)構(gòu)高度不均一性。

2.4 紅外光譜分析

從圖5可以看出, 雨生紅球藻多糖HPC1、HPC2和 HPC3紅外光譜有相似之處,如均在 3600～3200 cm-1、2925 cm-1附近處有糖環(huán)特征吸收峰; 雖然均在1640 cm-1和1410 cm-1附近有C═O非對稱和對稱伸縮振動峰, 但其相對強(qiáng)度各不相同, 說明樣品存在糖醛酸的含量不同, HPC3較高; 1240 cm-1區(qū)域的吸收峰表示S═O伸縮振動, HPC1含極少量硫酸基, HPC2, HPC3含有少量硫酸基, 該結(jié)果與表1結(jié)果相一致。

圖4 不同多糖的醋酸纖維素薄膜電泳圖Fig. 4 Cellulose acetate membrane electrophoresis graph of different polysaccharides

圖5 3種多糖的紅外光譜圖比較Fig. 5 The IR spectrum comparison of three kinds of polysaccharides

3 結(jié)論

以雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)為原料,首次通過冷水、熱水和熱堿提取得到3種粗多糖, 并從冷水提取多糖HPC中進(jìn)一步分離純化出3個多糖組分。各個組分單糖組成均很復(fù)雜, 單糖種類多達(dá)十余種, 該結(jié)果和本課題組從另一種單細(xì)胞綠藻——鹽藻中提取的多糖中單糖組成類似[10]。雨生紅球藻中單糖種類為何如此多樣, 其結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系如何等仍需要深入研究, 也為該類特殊多糖資源的開發(fā)利用提供了有用數(shù)據(jù)。

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Extraction and isolation of polysaccharides fromHaematococcus pluvialisand their physicochemical characters study

FENG Yi-ming1,2, LI Guang-sheng1,2, WU Jian-dong1,2, WANG Pei-pei1,2, ZHAO Xia1,2, YU Guang-li1,2
(1. Key Laboratory of Marine Drugs (Ocean University of China), Ministry of Education, Qingdao 266003, China;2. Shandong Provincial Key Laboratory of Glycoscience and Glycoengineering, Qingdao 266003, China)

Jan., 27, 2011

Haematococcus pluvialis; polysaccharide; Extraction; isolation; monosaccharide composition

Three kinds of crude polysaccharides HPC, HPH and HPA were obtained from aqueous extracts of the green algaHaematococcus pluvialiswith cold water, hot water and 5% Na2CO3water solution. The crude extracts were fractionated by ion-exchange chromatography of Q-Sepharose Fast Flow column. The purified extracts were named HPC1, HPC2 and HPC3. The monosaccharide composition, relative molecular mass (Mw) and structural feature of the polysaccharides were analyzed and compared by high-performance liquid chromatography (HPLC)and Fourier Transform Infrared spectroscopy (FTIR), respectively. The results showed that the monosaccharide composition was complicated and the main components included Galactose, Mannose, Arabinose, Glucose, Glucuronic acid, Galacturonic acid, Xylose, Rhamnose, Fucose, Glucosamine and Galactosamine. In particular, the content of Galactose was the highest and it’s higher than 20%. The relative molecular masses of polysaccharides HPC1, HPC2 and HPC3 were 502.6, 373.2, 577.5 and 300.5 ku, respectively.

Q949.21+2; R282.77 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1000-3096(2012)01-0017-06

2011-01-27;

2011-04-29

國家自然科學(xué)基金項目(31070724; 30870506); 國家海洋局公益專項(201005024)項目; 長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊發(fā)展計劃(IRT0944)項目資助

馮以明(1986-), 女, 山西長治人, 碩士研究生, 研究方向：海洋糖藥物; 于廣利, 通信作者, 教授, 電話：0532-82031609, E-mail：glyu@ouc.edu.cn

康亦兼)