張仕金， 朱 雄， 徐云根*

(1.中國藥科大學藥物化學教研室，江蘇 南京210009;2.中國藥科大學醫(yī)藥化工研究所，江蘇南京210009)

鬼臼毒素(podophyllotoxin，1)來源于盾葉鬼臼(podophyllum)的根莖提取物，早在19世紀初就被用于催吐、導瀉和驅蟲。研究表明:盾葉鬼臼具有抗有絲分裂活性，鬼臼毒素便是其抗有絲分裂的活性成分(Imbert，Biochimie，1998年)，且其抗有絲分裂機制與秋水仙堿類似，即通過與微管蛋白結合進而阻止微管蛋白聚合形成微管。然而，鬼臼毒素的水溶性差，生物利用度低，限制了其作為抗腫瘤藥物的應用。為了提高其生物利用度，山德士公司的研究人員在對強心苷化合物洋地黃和糖苷配基化合物毒毛旋花子的研究基礎上，確立了開發(fā)鬼臼毒素糖苷衍生物的研究思路，合成了一系列鬼臼毒素糖苷衍生物。其中，依托泊苷(etoposide，2)、替尼泊苷(teniposide，3)和依托泊苷磷酸鹽(etopophos，4)已在臨床上用于治療小細胞肺癌、白血病、乳腺癌等，并顯現(xiàn)出良好的療效，而依托泊苷更已成為腫瘤的一線治療藥物，常與其他抗腫瘤藥物聯(lián)合治療各種癌癥，如與貝伐單抗聯(lián)用于惡性膠質瘤，與氯法拉濱和環(huán)磷酰胺聯(lián)用于血液系統(tǒng)惡性腫瘤，或與長春新堿、阿霉素和地塞米松聯(lián)合治療卡波西肉瘤［1-3］。與依托泊苷相比，依托泊苷磷酸鹽臨床療效更持久，水溶性更佳。由于糖基側鏈的引入，依托泊苷的作用機制發(fā)生變化，其主要通過與拓撲異構酶Ⅱ結合，進而阻止了完整DNA鏈的形成，在細胞分裂S期和G2期阻止細胞的形成，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。很多研究都表明依托泊苷是通過形成DNA-藥物－拓撲異構酶Ⅱ復合物，最終抑制 DNA配對從而產生DNA單鏈及雙鏈片段，使腫瘤細胞周期終止于G期［4］。但是，這些鬼臼毒素糖苷衍生物仍存在骨髓抑制、中性粒細胞減少癥和惡心嘔吐等毒副作用。為此，研究人員選擇分別在鬼臼毒素A、C、D和E環(huán)上進行結構修飾，以期獲得抗腫瘤活性更佳、毒副作用更小的鬼臼毒素類化合物。

1 A環(huán)的修飾

天然產物中，與鬼臼毒素結構相似的化合物有山荷葉素(diphyllin，5)、爵床脂素B(justicidin B，6)和?；砭识舅?sikkimotoxin，7)，這些化合物與鬼臼毒素的主要不同之處在于前者無A環(huán)，此處為開環(huán)結構，而后者此處有一亞甲基二氧環(huán)結構。有研究表明:?；砭识舅丶捌溲苌锞哂屑毎拘圆⒛茉诩毎薪z分裂中阻止紡錘體的形成(Stahelin，Prog Drug Res，1989年)，因此，科研人員對鬼臼毒素結構中的A環(huán)進行了結構修飾。例如，Wang等(JMed Chem，1992年)合成了一系列6，7-二羥基-4β取代鬼臼毒素類似物。然而，體外活性測試結果顯示:與相應的保持6，7-位為亞甲基二氧環(huán)結構的化合物相比，該系列化合物對拓撲異構酶Ⅱ的抑制活性大大降低。Castro等［5］在其合成的一系列A環(huán)衍生物中也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象:6，7-位為羥基的衍生物(8)對白血病P-388細胞、肺癌A-549細胞、結腸癌HT-29細胞的活性明顯低于化合物9(兩者的IC50分別為1.3 vs0.003，1.3 vs 0.005，1.3 vs 0.005μmol·L－1)。Cho等(JMed Chem，1996年)合成了一系列A環(huán)吩嗪衍生物，并用人口腔癌KB細胞進行了細胞毒活性測試，結果發(fā)現(xiàn)，A環(huán)修飾后的化合物，如化合物10的活性［IC50=(0.11±0.03)μmol·L－1］明顯弱于A環(huán)未作修飾的化合物(11)［IC50=(0.032± 0.008)μmol·L－1］，由此認為隨著A環(huán)的改變，化合物的活性下降，這進一步印證了A環(huán)保持完整的重要性。

2 C環(huán)的修飾

目前，研究人員對鬼臼毒素的結構改造主要集中在C環(huán)，進入臨床應用的抗腫瘤藥物依托泊苷、替尼泊苷和依托泊苷磷酸鹽便是此類衍生物。另有幾個很有潛力的候選藥物也是經C環(huán)修飾的鬼臼毒素衍生物，如:處于Ⅱ期臨床研究中的NK-611 (12)、GL-331(13)和處于Ⅰ期臨床研究中的TOP-53(14)。其中，NK-611為依托泊苷的類似物，其因在C環(huán)的取代基上了引入了二甲氨基，使分子的成鹽性增加，生物利用度得以提高［6］。GL-331則是通過將依托泊苷糖基團替換為非糖基團而得到的化合物，藥理研究結果顯示其亦可通過抑制拓撲異構酶Ⅱ活性發(fā)揮抗腫瘤作用［7］。Taiho公司研發(fā)的TOP-53對非小細胞肺癌的抑制活性為依托泊苷的10倍，在治療轉移性肺癌方面療效良好［8-9］。

對C環(huán)的修飾通常選擇的是4位上的取代基，現(xiàn)已分別合成了一系列4位含氧衍生物和4位含氮衍生物，并初步考察了這些化合物的抗腫瘤活性。

2.1 4位含氧衍生物 研究人員對鬼臼毒素(或4'-去甲基鬼臼毒素)4位上羥基進行修飾后得到4位含氧衍生物。例如，Duca等［10］合成了一系列4β-氧衍生物，其中化合物15對白血病L1210細胞的抑制活性為依托泊苷的20倍，進一步的研究表明其對拓撲異構酶Ⅱ也具有抑制活性。Kamal等［11］合成了一系列4β-氧甲酰氨基衍生物，其中化合物16對乳腺癌、肺癌、卵巢癌等癌細胞的抑制活性均強于依托泊苷(見表1)。Xiang等［12］利用拼合原理，將5-氟尿嘧啶(5-FU)與4'-去甲基鬼臼毒素拼合得化合物17，活性測定結果顯示:該化合物在10μmol· L－1濃度下對白血病P-388細胞、肺癌A-549細胞和肝癌Bel-7402細胞的抑制率均大于依托泊苷和5-FU(見表2)。Passarella等［13］將鬼臼毒素的4位通過連接臂與硫代秋水仙堿拼合得化合物18。將鬼臼毒素和化合物18的溶液(10μmol·L－1)分別與純化后的牛微管蛋白(3 g·L－1)混合并于37℃下孵育15 min，加入 GTP誘導微管蛋白聚合，30 min后離心分離聚合和未聚合微管蛋白，并采用光密度測定法定量分析。結果顯示:在化合物18存在的條件下，聚合微管蛋白與未聚合微管蛋白的比例為(1.36±0.29);而在鬼臼毒素存在的條件下該比例為(0.80±0.1)，表明化合物18抑制微管蛋白聚合的能力弱于鬼臼毒素，提示并非所有化合物均可通過拼合原理連接不同抗腫瘤藥物以達到協(xié)同作用。此外，Yu等［14］合成的一系列4β-氧衍生物中也未出現(xiàn)理想中活性更好的化合物:在用宮頸癌HeLa細胞、卵巢癌 SKOV3細胞、白血病 K562和K562ADR細胞進行的活性測試中，僅化合物19的活性總體上與鬼臼毒素相當［兩者的IC50分別為(0.55±0.06)vs(0.10±0.02)，(0.31±0.04)vs (0.17±0.02)，(0.03±0.01)vs(0.03±0.01)，(0.30±0.05)vs(0.17±0.02)μmol·L－1］。

表1 化合物16和依托泊苷抗腫瘤活性比較Table1 Comparison of anti-tumor activity data of compound 16 and etoposide

表2 化合物17在濃度為10μmol·L－1時對腫瘤細胞的抑制率Table2 Inhibitory rates against tumor cells at 10μmol·L－1 of compound 17

2.2 4位含氮衍生物 Reddy和Bhat等人在鬼臼毒素(或4'-去甲基鬼臼毒素)的4位引入三氮唑基團，得一系列4位氮衍生物，體外活性測試結果顯示:化合物20、21對膠質瘤SF-295細胞、前列腺癌PC-3細胞和喉癌Hep-2細胞的抑制活性基本上優(yōu)于依托泊苷(見表3)［15-16］。Zhang等［17］合成了一系列4位5-FU取代的衍生物，腫瘤細胞活性測試結果顯示該類化合物均具有較強的細胞毒性，且5-FU的引入使鬼臼毒素類化合物的水溶性得到改善，有利于生物利用度的提高，化合物22為其代表性化合物。Duca等［18］合成了一系列具有拓撲異構酶Ⅱ抑制活性的4β-氨基甲酸酯衍生物，其中化合物23的抑制活性與依托泊苷相當(IC50=20μmol·L－1)，但細胞毒性(IC50=0.18μmol·L－1)強于依托泊苷(IC50=0.83μmol·L－1)。體外活性研究還顯示:隨著酯側鏈長度的延長，氨基甲酸酯衍生物對白血病細胞L2010的抑制活性下降。而Xi等［19］和Wang等［20］對各自合成的系列4β-氨基芳環(huán)衍生物進行的體外活性測試結果顯示:化合物24對肺癌A-549細胞和乳腺癌 MCF-7細胞的 IC50分別為0.71和0.92μmol·L－1，優(yōu)于GL-331(IC50分別為3.54和2.13μmol·L－1);化合物25對口腔癌KB細胞的 IC50為 1.91μmol·L－1，強于依托泊苷(IC50=4.61μmol·L－1)，且水溶性更好，更有利于口服吸收。此外，Kamal等［21-23］從 Becker等人(Bioorg Med Chem Lett，1998年)的研究中得知多芳環(huán)基團可增強化合物抗腫瘤活性，因此在鬼臼毒素的4位引入多芳環(huán)的疏水性基團，合成了一系列4β-氨基多芳環(huán)衍生物，其中大多數(shù)化合物對結腸癌細胞、肺癌細胞和肝癌細胞等均顯示出較強的細胞毒性，但非極性大基團的引入，也導致了生物利用度的下降。

表3 化合物20、21和依托泊苷抗腫瘤活性比較Table3 Comparison of anti-tumor activity data of compound 20，21 and etoposide

3 D環(huán)和E環(huán)的修飾

目前對鬼臼毒素D環(huán)和E環(huán)的研究相對較少，Castro等［24］通過打開D環(huán)，合成了一系列細胞毒性較強的衍生物，其活性濃度均低至微摩爾級。該研究還發(fā)現(xiàn)當9位為醛基或亞胺基，9'位為酯基時，活性保持得最好，如化合物26。

至于E環(huán)的改造，因通過對依托泊苷的結構研究已發(fā)現(xiàn)4'位為羥基時活性最好，故在結構改造時通常是先在4'位羥基上連接能被體內酶水解脫落的基團，即做成前藥，在體內重新釋放出羥基生成原形藥物，以增加吸收，提高藥效。此外，在峨?yún)⒌奶崛∥镏蟹蛛x出的鬼臼毒素類似物——去氧鬼臼毒素(deoxypodophyllotoxin，27)已被證明具有良好的抗腫瘤活性［25］?？蒲腥藛T通過在該化合物的4'位上引入一些極性基團以增加水溶性，提高生物利用度。例如，Chen等［26］在化合物27的4'位引入氨基酸基團，所得化合物的脂水分配系數(shù)的對數(shù)值(log P值)大多低于2，水溶性大于其前體化合物去氧鬼臼毒素(log P=3.16)，且體外細胞毒活性測試結果顯示:這些化合物對白血病細胞HL-60的IC50大多低于1μmol·L－1，優(yōu)于依托泊苷(IC50=2.85μmol·L－1)，對宮頸癌SiHa細胞和肺癌A549細胞的抑制活性(IC50均值分別為3.13和2.87μmol·L－1)明顯強于依托泊苷(IC50分別為40.4和24.9μmol·L－1)，而對宮頸癌Hela細胞的抑制活性與依托泊苷相當。Jin等［27］則在化合物27的4'位引入哌啶衍生物得化合物28，其哌啶環(huán)可形成季銨鹽，從而有望增加化合物的水溶性。體外活性測定結果顯示:其對肺癌A-549細胞、宮頸癌Hela和 SiHa細胞的 IC50分別為0.102、0.18、0.019 5μmol·L－1;均強于依托泊苷(IC50分別為14.8、50.6和30.7μmol·L－1)。

4 結語

綜上所述，鬼臼毒素衍生物的結構改造及構效關系有如下特點:

1 )A環(huán)亞甲基二氧環(huán)的結構完整對保持活性很重要(Wang等，JMed Chem，1992年)。

2 )C環(huán)4位是結構改造的主要部位，與4位為α構型的化合物相比，4位為β構型的化合物活性更強［14］，在該位置可通過-N-和-O-引入糖配體或其他非糖結構。

3)D環(huán)與C環(huán)為反式稠合，D環(huán)打開后所得化合物仍具有一定的活性［24］。

4 )E環(huán)為α構型，結構改造主要集中在4'位，該位置為-OH時方顯示出良好活性，故可利用前藥原理，在羥基上引入極性基團以達到增溶效果，引入的基團在體內可通過酶或非酶作用脫去。

依托泊苷水溶性差，故臨床上常通過加入助溶劑的方式改善依托泊苷的溶解性，但助溶劑的加入可能會帶來意想不到的副作用。盡管依托泊苷磷酸鹽的研發(fā)改善了依托泊苷的水溶性問題，但隨著該類藥物的推廣使用，也已出現(xiàn)了耐藥性的問題，因此，進一步開發(fā)毒性小、療效高的鬼臼毒素新型衍生物，克服現(xiàn)有藥物的耐藥性，已成為抗腫瘤藥物研究的熱點。

目前進行的研究工作主要集中在鬼臼毒素的C4位以及去氧鬼臼毒素的C4'位取代基上，根據(jù)生物電子等排、拼合和前藥原理等進行新藥設計，一些具有較強抗腫瘤活性的新化合物被相繼發(fā)現(xiàn)。筆者所在課題組正在以去氧鬼臼毒素為先導物進行結構修飾，已取得一些階段性結果。隨著對DNA拓撲異構酶Ⅱ的作用機制的闡明，基于該酶結構進行的鬼臼毒素類化合物的結構改造將有可能幫助我們發(fā)現(xiàn)更安全和更高效的抗腫瘤候選化合物。

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