胡貝貞，宋偉華，董文洪

（紹興出入境檢驗檢疫局，浙江紹興 312000）

固相萃取-液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法測定黃酒中的甜蜜素

胡貝貞，宋偉華，董文洪

（紹興出入境檢驗檢疫局，浙江紹興 312000）

建立了黃酒中甜蜜素殘留的固相萃取-液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法（SPE-LC/MS/MS）測定方法。黃酒樣品用水稀釋后，弱陰離子（WAX）固相萃取小柱凈化，氨化甲醇洗脫。采用Hypersil Gold C18色譜柱（150mm×2.1 mm，5 μm），乙腈－0.1%甲酸水溶液為流動相，以電噴霧離子源負離子模式（MRM）定性、定量測定甜蜜素。甜蜜素在10～500μg/L范圍內(nèi)峰面積與質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 5。取有代表性的陰性樣品進行添加回收試驗，在 0.5～5.0mg/L 范圍內(nèi)，回收率為 81.1%～88.2%，相對標準偏差為 3.65%～5.21%，方法的定量檢測限為 0.5 mg/L。該方法凈化效果好，檢測靈敏度高，能同時完成黃酒中甜蜜素的定量和定性分析。

固相萃??；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；黃酒；甜蜜素

甜蜜素（Sodium Cyclamate）的化學(xué)名為環(huán)己基氨基磺酸鈉，是一種人工合成的水溶性、高甜度且價格低廉的甜味劑。甜蜜素在我國廣泛用于食品加工行業(yè)，但其超量、超范圍使用現(xiàn)象嚴重［1］。過量攝入甜蜜素有致癌、致畸、損害腎功能等副作用，目前日本、美國、英國等40多個國家禁止將甜蜜素作為食品甜味劑。根據(jù)GB 2760-2011《食品添加劑使用衛(wèi)生標準》規(guī)定，甜蜜素不得用于除配制酒以外的酒類中，而黃酒屬于發(fā)酵酒，在禁用食品之列。黃酒是我國出口的大宗酒類產(chǎn)品之一，其中出口黃酒有很大部分銷往日本市場，而日本已于1969年禁用甜蜜素。為了保障國內(nèi)外消費者的權(quán)益，建立黃酒中甜蜜素準確、可靠的分析方法有著重要意義。

目前測定甜蜜素的方法主要有氣相色譜法［2-4］、氣質(zhì)聯(lián)用法［5-7］、液相色譜法［8，9］、離子色譜法［10，11］等。其中常用的方法為在酸性條件下用亞硝酸鈉將甜蜜素衍生成環(huán)己基亞硝酸酯再供氣相色譜測定，如文獻［2，3］，但酒中固有的環(huán)己醇、環(huán)己基類化合物會產(chǎn)生假陽性結(jié)果，該方法不適合酒類產(chǎn)品中甜蜜素的檢測；第2種常用的方法為在酸性條件下用次氯酸鈉將甜蜜素衍生成N，N-二氯代環(huán)己基胺再供液相色譜或氣質(zhì)聯(lián)用測定［5,8］，該方法雖不會產(chǎn)生第1種方法中的干擾，但筆者在幾年的實際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)液相紫外法在衍生產(chǎn)物N，N-二氯代環(huán)己基胺出峰處有雜質(zhì)干擾，靈敏度較差，檢出限高，且無法進行陽性確證，氣質(zhì)聯(lián)用法雖然能進行陽性確證，但需要衍生化，操作繁瑣，檢測靈敏度不理想。

近年來，有不少LC-MS-MS用于甜蜜素檢測的報道，如文獻［12-14］，該方法無需衍生，檢測靈敏度高，但存在的問題是無樣品前處理過程，LC-MS-MS易受基質(zhì)干擾而存在嚴重的離子抑制效應(yīng)，導(dǎo)致定量不準確；此外，較臟的樣品極易引起離子傳輸管污染，導(dǎo)致儀器維護頻繁，所以在檢測基質(zhì)復(fù)雜的樣品時，這些方法的應(yīng)用受到限制。

黃酒樣品基質(zhì)復(fù)雜，無法采用直接進樣法分析，筆者根據(jù)甜蜜素的結(jié)構(gòu)特點，應(yīng)用Waters弱陰離子（WAX）交換小柱進行樣品前處理，凈化效果好，彌補了上述方法的不足，適合復(fù)雜基體樣品中甜蜜素檢測的前處理。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：TSQ Quantum Acess三重四極桿型，美國Thermo Fisher公司；

純水發(fā)生器：Elix5型，美國M illipore公司；

超純水器：SYNERY型，美國M illipore公司；

甜蜜素標準品：純度99%，德國Dr.公司；

Oasis WAX弱陰離子交換固相萃取小柱：60mg/（3 m L），美國Waters公司，使用前分別用3 m L甲醇、3 m L 2%（體積分數(shù)）甲酸溶液預(yù)活化；

乙腈、甲醇、甲酸：色譜純，美國TEDIA公司；

尼龍微孔過濾頭：孔徑0.22 μm，北京振翔公司；

甜蜜素標準儲備液：1 000mg/L，準確稱取200mg標準品于200m L容量瓶中，用超純水定容至刻度。使用時用超純水稀釋至合適的濃度。

實驗用水為超純水。

1.2 儀器分析條件

（1）液相色譜條件

色譜柱：Hypersil Gold C18色譜柱（150mm×2.1 mm，5 μm）；柱溫：25℃；流動相：0.1% 甲酸溶液 -乙腈（體積比為80︰20），等度洗脫；流速：200μL/min；進樣量：10μL。

（2）質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：負離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；電噴霧電壓：3 000V；霧化氣（高純氮氣）：137 894 Pa；輔助氣（高純氮氣）：34 473 Pa；碰撞氣（高純氬氣）：0.2 Pa；甜蜜素母離子：m/z 178.0，子離子 m/z 80.2 ；碰撞電壓：27 V。

1.3 樣品處理方法

取1 m L黃酒，用超純水稀釋至25 m L，取1 m L加入到已活化好的WAX小柱上，重力過柱，然后分別用3 m L 2%（體積分數(shù)）甲酸溶液、3 m L甲醇淋洗，真空抽干，用3 m L 5%（體積分數(shù)）氨化甲醇洗脫，洗脫液于45℃水浴中氮吹至干，用1.0m L超純水定容，過0.22 μm濾膜，濾液供液質(zhì)聯(lián)用分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相條件的優(yōu)化

比較了乙腈-水體系和乙腈- 0.1%甲酸體系，發(fā)現(xiàn)乙腈-水作為流動相時，甜蜜素的離子化效率很低，沒有檢測目標物峰，而在體系中加入0.1%的甲酸后，離子化效率大大提高，質(zhì)譜效應(yīng)較好，檢出限滿足要求。通常在電噴霧正離子模式下，化合物母離子常為［M+H］+，為了提高離子化效率，需要加入甲酸、乙酸等作供質(zhì)子體，而本實驗負離子模式下化合物母離子為［M-Na］+，理論上無需加入甲酸等，而實際發(fā)現(xiàn)不加入甲酸甜蜜素根本無法出峰，而加入甲酸后則能獲得很好的響應(yīng)，在負離子模式下測定其它母離子為［M-H］+的物質(zhì)時也存在這一現(xiàn)象。

實驗考察了不同體積比的乙腈- 0.1%甲酸體系對峰形的影響，分別在體積比20︰80，30︰70，50︰50時采集譜圖，由峰形對比發(fā)現(xiàn)隨著乙腈含量的增加，甜蜜素的峰形漸漸變差，這是由于甜蜜素是完全離子化的溶于水的物質(zhì)，隨著流動相中有機相的增加，互溶性變差，導(dǎo)致峰形變差。實驗選擇乙腈- 0.1%甲酸體積比為20︰80，等度洗脫，在該條件下甜蜜素峰形和靈敏度較好。圖1為20μg/L的甜蜜素標準溶液的色譜圖。

圖1 L甜蜜素標準溶液色譜圖

2.2 定容液的選擇

實驗發(fā)現(xiàn)，用流動相定容時，當(dāng)標準溶液的濃度稍微高一些時，甜蜜素的峰形變差，出現(xiàn)“饅頭峰”，而用純水定容時則能獲得較好的峰形和響應(yīng)，圖2和圖3為200μg/L標準品分別用流動相和純水定容時的色譜圖。由圖2和圖3可知，濃度較高的甜蜜素標準溶液未能完全溶解在含一定比例乙腈有機相的流動相中，而能完全溶于純水中。為保證高濃度溶液的峰形和響應(yīng)值，拓寬標準曲線的線性范圍，實驗選擇純水為定容液。

圖2 200μg/L標準品用流動相定容時的色譜圖

圖3 200μg/L標準品用純水定容時的色譜圖

2.3 凈化條件的選擇

嘗試采用水稀釋后直接進樣，發(fā)現(xiàn)雖然譜圖上顯示雜質(zhì)干擾不大，但是黃酒中含有大量的色素、糖、有機酸等，這些物質(zhì)在稀釋后的樣品中含量很高，若不經(jīng)凈化去除而直接進入儀器系統(tǒng)，容易造成儀器的污染，方法的耐用性受到限制，因此實驗選擇固相萃取法以達到凈化的目的。

甜蜜素是完全電離的鹽，分子結(jié)構(gòu)中含有磺酸基負離子基團，實驗采用Waters公司生產(chǎn)的WAX弱陰離子交換小柱凈化。這種小柱在酸性條件下填料表面電離帶正電，能吸附帶負電的環(huán)己基氨基磺酸基負離子，可吸附目標物，在堿性條件下填料表面不帶電，可對目標物進行洗脫。預(yù)先采用3 m L 2%（體積分數(shù)）甲酸溶液活化小柱，使填料帶上正電，能吸附帶負電的氨基環(huán)己基磺酸基負離子，而后依次用2%（體積分數(shù)）甲酸溶液、甲醇清洗柱子，去除水溶性和其它溶于有機溶劑的雜質(zhì)，最后用5%（體積分數(shù)）氨化甲醇淋洗小柱，使小柱填料呈電中性，將目標物洗脫下來。采用WAX小柱凈化后，譜圖基線有所下降，而大量雜質(zhì)在凈化過程中被去除，使方法的耐用性大大提高。

2.4 線性方程、回收率、精密度及定量限

將標準儲備液用純水稀釋成 10，50，100，200，500μg/L的系列標準工作溶液，進樣分析，以響應(yīng)值Y為縱坐標，濃度X（μg/L）為橫坐標繪制標準曲線，線性方程為 Y=1 520.36X+8 260.55，r2＝0.999 5。同時取陰性黃酒樣品，分別添加 5.0，2.0，0.5 mg/L 3個濃度的標準品，每個濃度做5個平行樣品，考察回收率和精密度，結(jié)果見表1。以回收率和精密度都能獲得較理想數(shù)據(jù)的濃度點作為定量限，本方法定量限為 0.5 mg/L。

表1 回收率及精密度試驗結(jié)果（n=5）

3 結(jié)語

建立了黃酒中甜蜜素的固相萃取-液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，方法凈化效果好，耐用性強，適合日常大批量樣品的檢測，滿足產(chǎn)品中目標物的定性和定量要求。

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Determ ination of Sodium Cyclamate in Rice W ine by Solid Phase Extraction-Liquid Chromatography-Tandem M ass Spectrometry

Hu Beizhen，Song Weihua，Dong Wenhong
(Shaoxing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shaoxing 312000，China)

A solid phase extraction -liquid chromatography/tandem mass spectrometry method for determ iantion of sodium cyclamate was developed. The rice w ine sample was diluted w ith ultra pure water，purified w ith WAX SPE coulmn，eluted w ith ammoniated methanol，then the sodium cyclamate in the sample was detected by LC-MS-MS in MRM mode using Hypersil Gold C18column（150mm×2.1 mm，5μm） and acetonitrile-0.1% formic acid as mobile phase.The sodium cyclamate mass concentration was linear w ith peak area in the range of 10-500μg/L, w ith the correlation coeffi cient of 0.999 5. The recoveries of sodium cyclamate spiked in samples at three levels ranged from 81.1% to 88.2%w ith the relative standard deviation of 3.65% -5.21%(n=5). The lim it of quantification was 0.5 mg/L. The method is sensitive and it can simultaneously complete quantifi cation and qualitation analysis of sodium cyclamate in rice w ine.

SPE; LC-MS-MS; rice w ine; sodium cyclamate

O657.7+2

A

1008-6145(2012)01-0055-03

10.3969/j.issn.1008-6145.2012.01.017

聯(lián)系人：胡貝貞；E-mail:hubeizhen_002@yahoo.com.cn

2011-11-16