蔣宏 胡貝貞，宋偉華

（建德市質(zhì)量計(jì)量監(jiān)測(cè)中心，浙江建德 311600） （紹興出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江紹興 312000）

微波輔助萃取–液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定植物源產(chǎn)品中的阿維菌素B1a殘留量

蔣宏 胡貝貞，宋偉華

（建德市質(zhì)量計(jì)量監(jiān)測(cè)中心，浙江建德 311600） （紹興出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江紹興 312000）

建立了植物源產(chǎn)品茶葉、糧谷、中藥材中阿維菌素B1a殘留量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）測(cè)定方法。樣品用丙酮-二氯甲烷（體積比1∶1）微波輔助提取，提取液經(jīng)石墨化炭黑/氨基（Carb/NH2）固相萃取小柱凈化。采用Hypersil Gold C18色譜柱（150mm×2.1 mm，5μm），乙腈-2.5 mmol/L乙酸銨水溶液為流動(dòng)相，以電噴霧電離正離子（ESI+）、多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）定性、定量測(cè)定阿維菌素B1a，采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)外標(biāo)法定量。在5～100μg/L范圍內(nèi)，阿維菌素B1a的峰面積與質(zhì)量濃度呈線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.998，方法的檢出限（S/N＞3）為5 μg/kg，定量限（S/N＞10）為10μg/kg。取有代表性的綠茶、小麥、丹參陰性樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，在10，50μg/kg加標(biāo)水平下，回收率為75%～87%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.04%～6.38%(n=5)。該法提取效果好、凈化較徹底，靈敏度滿(mǎn)足國(guó)內(nèi)外限量標(biāo)準(zhǔn)的要求，適合復(fù)雜基質(zhì)植物源產(chǎn)品中阿維菌素B1a殘留量的測(cè)定。

微波輔助萃??；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；植物源產(chǎn)品；阿維菌素B1a

阿維菌素類(lèi)生物農(nóng)藥是從鏈霉菌的發(fā)酵產(chǎn)物中分離出來(lái)的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，對(duì)動(dòng)植物的寄生線(xiàn)蟲(chóng)和節(jié)肢動(dòng)物均有高效的驅(qū)殺作用，是一種優(yōu)良的新型農(nóng)畜兩用抗生素，廣泛用于作物種植與動(dòng)物養(yǎng)殖中［1］。這類(lèi)藥物包括阿維菌素（Avermectin，AVM）、伊維菌素、多拉菌素、莫西菌素、乙?；⒕S菌素、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽等。阿維菌素根據(jù)取代基不同可分為 A1a，A1b，A2a，A2a，B1a，B1b，B2a，B2b 8個(gè)組分，其中B1a的活性最強(qiáng)，故把B1a（≥80%）和B1b（≤20%）合稱(chēng)作阿維菌素（Avermectin B1）［2］。阿維菌素作為甲胺磷等高毒有機(jī)磷農(nóng)藥的替代品廣泛用于蔬菜、果樹(shù)、棉花、花卉等，目前已在很多國(guó)家登記使用。

阿維菌素雖屬于微生物源農(nóng)藥，但是按世界衛(wèi)生組織5級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，仍屬高毒農(nóng)藥，對(duì)哺乳動(dòng)物的繁殖能力具有潛在毒性［3］。因此，國(guó)際上對(duì)阿維菌素殘留的檢測(cè)十分重視，制訂了嚴(yán)格的殘留限量，如歐盟詳細(xì)規(guī)定了其在果蔬、谷物中的殘留限量為10μg/kg，歐盟法規(guī)（EC）No.149/2008規(guī)定了茶葉中阿維菌素B1a的殘留限量為20μg/kg，日本則不允許將阿維菌素用于茶葉種植中。

阿維菌素相對(duì)分子質(zhì)量大，極難氣化，尚無(wú)可行的氣相色譜衍生化方法，檢測(cè)方法主要有液相色譜 - 熒光檢測(cè)法［4，5］和酶聯(lián)免疫法［6］，前者較常用，但需要繁瑣的衍生化反應(yīng)；后者則存在假陽(yáng)性現(xiàn)象，只能用于篩選，不能作為確證方法。近年來(lái)，LC-MS-MS方法(電噴霧或大氣壓化學(xué)電離)測(cè)定阿維菌素屢見(jiàn)報(bào)道［7-10］。這些方法主要集中在動(dòng)物源食品或單一、簡(jiǎn)單的基質(zhì)，凈化過(guò)程較簡(jiǎn)單、不徹底，而茶葉、中藥材等產(chǎn)品含有大量的色素、蠟質(zhì)、有機(jī)酸、生物堿等各種復(fù)雜的化學(xué)成分，再加上殘留的農(nóng)藥濃度通常較低，造成這些產(chǎn)品中阿維菌素的提取、分離、凈化與富集的難度較大，需要有針對(duì)性地探索一套適合的分析方法。

筆者在前人研究的基礎(chǔ)上，選取阿維菌素中活性最大的B1a組分為研究對(duì)象，選用具有萃取效率高、成本低、污染小等優(yōu)點(diǎn)的微波輔助萃取法，并對(duì)凈化條件和質(zhì)譜、色譜檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了茶葉、糧谷、中藥材3種植物源基質(zhì)中阿維菌素B1a的測(cè)定方法，該方法提取效果好，凈化較徹底，靈敏度滿(mǎn)足歐盟、日本等國(guó)的殘留限量要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：TSQ Quantum Acess三重四極桿型，美國(guó)Thermo Fisher公司；

微波萃取儀：Mars X Press型，美國(guó)CEM公司；

純水發(fā)生器：Elix5型，美國(guó)M illipore公司；

超純水發(fā)生器：SYNERY型，美國(guó)M illipore公司；

氮吹儀：N-EVAP-12型，美國(guó)Organomation公司；

超離心研磨儀：ZM 200型，德國(guó)萊馳公司；

分析天平：PL-203型，瑞士梅特勒公司；

阿維菌素B1a標(biāo)準(zhǔn)溶液：100μg/m L，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所，使用時(shí)用丙酮稀釋?zhuān)?/p>

Carb/NH2固相萃取小柱：500mg/500mg/(6 m L)，杭州福裕科技服務(wù)有限公司，使用前用3 m L丙酮－二氯甲烷（體積比1∶1）預(yù)活化；

乙腈、丙酮、二氯甲烷、乙酸銨：色譜純，美國(guó)TEDIA公司；

乙酸銨水溶液：2.5 mmol/L，稱(chēng)取0.077 g乙酸銨，加適量超純水溶解后定容至1 000m L；

尼龍微孔過(guò)濾頭：孔徑0.22 μm，北京振翔公司；

實(shí)驗(yàn)用水：超純水。

1.2 儀器分析條件

（1）液相色譜條件

色譜柱：Hypersil Gold型C18色譜柱（150mm×2.1 mm，5 μm）；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10μL ；流動(dòng)相：乙腈-2.5 mmol/L乙酸銨水溶液，流速為200μL/m in，梯度洗脫程序見(jiàn)表 1。

表1 梯度洗脫程序

（2）質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；電噴霧電壓：4 000V；霧化氣：高純氮?dú)猓?41.3 kPa；輔助氣：高純氮?dú)猓?4.5 kPa；碰撞氣：高純氬氣，0.2 Pa；阿維菌素B1a母離子：m/z 890.6，子離子m/z 305.1，m/z 567.4；碰撞電壓：30，12 V；定量離子對(duì)為m/z 890.6→ 305.1。

1.3 樣品處理方法

（1）提取

將樣品用超離心研磨儀粉碎，過(guò)0.5 mm篩。稱(chēng)取0.5 g樣品（精確至0.01 g），裝入微波萃取罐中，加入15 m L丙酮-二氯甲烷（體積比1∶1），放入微波萃取儀中進(jìn)行萃取。微波萃取條件：5 min內(nèi)升溫至60℃，保持5 m in，然后在5 m in內(nèi)升溫至90℃，保持15 m in，微波功率為400W。萃取完畢，將萃取液過(guò)濾至50m L圓底玻璃燒瓶中，殘?jiān)偌?5 m L溶劑重復(fù)上述提取步驟再提取一遍，合并萃取液，于35℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約1 m L，待凈化。

（2）凈化

將上述（1）中的待凈化液加入到已活化好的Carb/NH2固相萃取小柱上，用約1 m L丙酮-二氯甲烷（體積比1∶1）洗滌燒瓶，洗滌液加到小柱上。待凈化液全部過(guò)柱后，再加5 m L丙酮-二氯甲烷（體積比1∶1）洗脫，用10m L刻度離心管收集所有流出物，于45℃水浴中氮?dú)獯蹈桑瑲堅(jiān)?.5 m L乙腈-2.5 mmol/L乙酸銨水溶液（體積比1∶1）溶解后過(guò)0.22 μm尼龍微孔過(guò)濾頭，供LC-MS-MS測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜、色譜條件的優(yōu)化

阿維菌素B1a在電噴霧電離（ESI）或大氣壓化學(xué)電離（APCI）源下均能獲得可靠的母離子和子離子，考慮到大多數(shù)農(nóng)藥分析在ESI模式下進(jìn)行，在僅有一臺(tái)儀器的情況下切換離子源比較繁瑣，故實(shí)驗(yàn)選擇ESI電離源。在ESI+模式下，阿維菌素B1a的加合離子峰主要有［M+NH4］+和［M+Na］+。在流動(dòng)相存在的情況下進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化，分別以乙腈-水（體積比1∶1）和乙腈-0.1%甲酸（體積比1∶1）為流動(dòng)相時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)阿維菌素B1a的加合離子峰主要為［M+Na］+，但強(qiáng)度弱，靈敏度較差，而在流動(dòng)相中加入5 mmol/L乙酸銨時(shí)，發(fā)現(xiàn)加合離子峰主要為［M+NH4］+，且強(qiáng)度大大增加，因此在流動(dòng)相中添加乙酸銨，選擇信號(hào)強(qiáng)且穩(wěn)定的［M+NH4］+加合離子峰作為母離子。

研究表明，過(guò)高的離子濃度對(duì)分析物的電離具有較強(qiáng)的抑制作用，因此，為提高靈敏度，有必要對(duì)質(zhì)譜分析時(shí)的緩沖鹽濃度進(jìn)行優(yōu)化。考察了緩沖鹽及酸的濃度對(duì)分析物信號(hào)強(qiáng)度的影響，選用的水相流動(dòng)相分別為5 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸，5，2.5，1 mmol/L 乙酸銨，將 10μg/L 的阿維菌素B1a標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，加入0.1%甲酸對(duì)信號(hào)有抑制作用，當(dāng)乙酸銨濃度為2.5 mmol/L時(shí)分析物相應(yīng)信號(hào)最強(qiáng)；當(dāng)乙酸銨濃度為1 mmol/L時(shí)信號(hào)略有下降。為取得較高靈敏度，選擇乙腈-2.5 mmol/L乙酸銨水溶液為流動(dòng)相。

2.2 提取條件的選擇和優(yōu)化

微波萃取是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的快速提取方法，是目前國(guó)際上推崇的有機(jī)物提取手段之一［11，12］。因此優(yōu)選微波萃取(MAE)法，并將其與加速溶劑萃取(ASE)法進(jìn)行對(duì)比。因?qū)嶒?yàn)中無(wú)法獲得含有阿維菌素B1a的陽(yáng)性樣品，筆者由實(shí)際檢測(cè)工作中茶葉陽(yáng)性樣品中其余農(nóng)藥萃取時(shí)所得經(jīng)驗(yàn)可知，兩種萃取方式均能有效地將殘留農(nóng)藥提取出來(lái)，為使殘留物提取完全，均需對(duì)殘?jiān)M(jìn)行二次提取。由于ASE是單個(gè)樣品依次提取，而MAE能同時(shí)萃取一批樣品，為了節(jié)約萃取時(shí)間，選擇MAE萃取法。

2.3 凈化條件的優(yōu)化

茶葉、中藥材、谷物中色素含量較高，是主要的干擾雜質(zhì)，另外還有脂肪、有機(jī)酸、蠟質(zhì)等雜質(zhì)。采用文獻(xiàn)所用的C18小柱、QuEChERS（加C18粉）、液液萃取等凈化方法均無(wú)法有效去除雜質(zhì)，易導(dǎo)致儀器受污染，且基質(zhì)效應(yīng)十分突出。凝膠滲透色譜（GPC）凈化是去除色素、脂肪、蠟質(zhì)等大分子雜質(zhì)的有效手段，但實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)由于阿維菌素B1a的相對(duì)分子質(zhì)量較大，不能與大部分色素有效分離，無(wú)法用GPC凈化。石墨化炭黑/氨基小柱是去除色素時(shí)最常用的小柱，但不同生產(chǎn)商的石墨化炭黑對(duì)目標(biāo)物的吸附性能不同，實(shí)驗(yàn)選用的石墨化炭黑/氨基小柱能用低沸點(diǎn)的丙酮-二氯甲烷洗脫目標(biāo)物，色素等能被有效去除，凈化效果好，又有利于后續(xù)氮吹濃縮，僅用5 m L就能將阿維菌素B1a洗脫下來(lái)。

由于采用微波萃取提取效率高，大量雜質(zhì)同時(shí)被提取出來(lái)，小柱易過(guò)載。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)茶葉樣品提取液雜質(zhì)特別多，1.0g樣品提取液會(huì)導(dǎo)致500mg/500mg規(guī)格的小柱過(guò)載，0.5 g樣品則不會(huì)，所以實(shí)驗(yàn)選擇稱(chēng)取0.5 g樣品。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)考察

取陰性的綠茶、小麥、丹參樣品，按1.3步驟處理，獲得0.5 m L空白基質(zhì)液。阿維菌素B1a儲(chǔ)備液用丙酮逐級(jí)稀釋至 10μg/L，取 100μL 此標(biāo)準(zhǔn)溶液4份，室溫下在氮?dú)饬飨戮徛舾杀〉?份加入初始流動(dòng)相乙腈-2.5 mmol/L乙酸銨水溶液（體積比 1∶1），取2，3，4份分別加入上述3種空白基質(zhì)液，重新溶解后進(jìn)樣測(cè)定，對(duì)比基質(zhì)標(biāo)樣與純?nèi)軇?biāo)樣的響應(yīng)值，見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，阿維菌素B1a在3種樣品基質(zhì)存在時(shí)，響應(yīng)值均有不同程度提高，存在較強(qiáng)的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。為了準(zhǔn)確定量，需要用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)定量。

2.5 線(xiàn)性關(guān)系、檢出限、定量限

用丙酮配制濃度為 5，10，25，50，100μg/L 的系列阿維菌素B1a標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，各取100μL，室溫下于氮?dú)饬髦芯徛舾杀?.4中空白基質(zhì)液，向每個(gè)濃度點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入100μL空白基質(zhì)液重新溶解，獲取系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣測(cè)定，以響應(yīng)值Y為縱坐標(biāo)，濃度X（μg/L）為橫坐標(biāo)，繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

圖1 10μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液在純流動(dòng)相及不同樣品基質(zhì)中響應(yīng)值相對(duì)強(qiáng)度的比較

在3種樣品基質(zhì)中，阿維菌素B1a的濃度在5～100μg/L范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.998（見(jiàn)表2）。以信噪比（S/N）大于3確定檢出限（LOD）為5 μg/kg，以S/N大于10且回收率和精密度較好的濃度點(diǎn)確定定量限（LOQ）為10μg/kg。圖2為5 μg/L的阿維菌素B1a標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖。

圖2 阿維菌素B1a標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

表2 線(xiàn)性方程及相關(guān)系數(shù)

2.6 方法回收率和精密度

在陰性綠茶、小麥、丹參樣品中分別添加10，50μg/kg兩個(gè)水平的目標(biāo)物進(jìn)行回收試驗(yàn)，重復(fù)測(cè)定5次，方法的回收率和測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）見(jiàn)表3。

表3 回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.7 樣品測(cè)定

對(duì)企業(yè)送檢的出口歐盟的茶葉及釀酒的原料小麥各測(cè)定50份，當(dāng)?shù)厮幍曩?gòu)買(mǎi)的不同產(chǎn)地的丹參樣品測(cè)定10份，均未檢出阿維菌素B1a殘留。

3 結(jié)語(yǔ)

采用液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法建立了植物源產(chǎn)品茶葉、糧谷、中藥材中阿維菌素B1a殘留的測(cè)定方法。本方法采用微波輔助萃取，提高了復(fù)雜基質(zhì)中目標(biāo)物的提取效率；采用石墨化炭黑/氨基柱凈化，有效除去了主要干擾物色素，凈化效果較好。方法靈敏度好，回收率和精密度較穩(wěn)定，適合復(fù)雜基質(zhì)中阿維菌素B1a殘留的確證和定量。

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Determ ination of Avermectin B1a Residues in Plant-originated Foodstuffs by M icrowave Assisted Extraction–Liquid Chromatography Tandem M ass Spectrometry

Jiang Hong
(Jiande Supervision Testing Center of Quality and Metrology,Jiande 311600, China)Hu Beizhen，Song Weihua
(Shaoxing Inspection and Quarantine Bureau, Shaoxing 312000，China)

A m icrowave assisted extraction-liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the determ iantion of avermectin B1a residues in tea，cereals and Chinese herbal medicine was developed. The sample was extracted by m icrowave assisted extraction w ith acetone-dichloromethane(volume ratio was 1∶1) as solvent，the extract was cleaned up by Carb/NH2SPE column. The separation was performed on a Hypersil Gold C18column(150mm×2.1 mm，5 μm) and w ith the gradient elution of acetonitrile and water (containing 2.5 mmol/L ammonium acetate). Avermectin B1a was determ ined in the mode of electrospry positive ionization (ESI+) and multiple reaction monitoring(MRM). The quantification was carried out by matrix-matched external standard curve，the calibration curves showed good linearity in the concentration range of 5-100μg/L and the correlation coefficient was more than 0.998. The limit of detection(S/N ＞ 3) was 5 μg/kg and the lim it of quantification (S/N ＞ 10) was 10μg/kg. The recoveries in green tea，wheat and danshen samples at spiked levels of 10, 50μg/kg ranged from 75% to 87%，w ith the relative standard deviation of 4.04% - 6.38%(n=5). The method established has advantages in extraction and purification and is sensitive enough in meeting the requirements of maximum residue lim it (MRL) of avermectin B1a. The method is suitable for determ ination of avermectin B1a in plant-originated foodstuffs w ith complex matrix.

microwave assisted extraction; LC-MS-MS; plant-originated foodstuffs; avermectin B1a

O657.7

A

1008–6145(2012)02–0045–04

10.3969/j.issn.1008–6145.2012.02.013

聯(lián)系人：胡貝貞；E-mail: hubeizhen_002@yahoo.com.cn

2011-12-29