于素香，孫玉國，王春艷

(承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000)

葉酸是機(jī)體參與核酸合成的重要生化成分，以往臨床上主要用于治療貧血，自上世紀(jì)90年代始用于預(yù)防胎兒神經(jīng)管畸形和先天性心臟病等出生缺陷性疾病，因此葉酸預(yù)防出生缺陷的機(jī)制及安全性成為研究熱點(diǎn)。胎盤作為為胎兒提供營養(yǎng)的特有器官，其細(xì)胞增殖狀態(tài)與胎盤發(fā)育及胎兒的存活密切相關(guān)。增殖細(xì)胞核抗原(PCNA）是DNA聚合酶δ的重要輔助因子，在DNA復(fù)制、細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要作用[1]。已有關(guān)于葉酸在體外對胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖影響的研究，但未見葉酸對胎盤細(xì)胞增殖狀況影響的報(bào)道。本研究通過觀察葉酸對妊娠大鼠胎盤細(xì)胞PCNA表達(dá)的影響，探討葉酸對發(fā)育中胎盤細(xì)胞的作用及機(jī)制，為葉酸預(yù)防出生缺陷的科學(xué)性研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 小鼠抗大鼠PCNA單克隆抗體、二步法免疫組化檢測試劑PV-9005、DAB顯色劑，北京中杉金橋生物技術(shù)限公司;葉酸，上海生物化學(xué)制藥廠(批號20090207）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物分組、受孕、干預(yù)和取材 8-10周齡健康清潔級SD大鼠60只(北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物中心提供，合格證號:SCK京1009-0008），體重210-250g，雌鼠40只，雄鼠20只。雌性大鼠隨機(jī)分為4組:對照組、大、中、小劑量葉酸組，每組10只。所有大鼠于普通籠具中適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，按雌雄2:1比例合籠，次晨觀察到陰栓者確定為受孕，記為E 0.5d。從受孕之日起，大、中、小劑量葉酸組大鼠分別給予葉酸2mg/kg/d、1mg/kg/d、0.5mg/kg/d灌胃;對照組大鼠給予等容積生理鹽水。各組孕鼠于E 13.5d取材，每只孕鼠隨機(jī)取一個胎盤，Bouins液固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚5μm。

1.3 HE染色 常規(guī)HE染色，Olympus顯微鏡下觀察并攝片。

1.4 免疫組織化學(xué)染色及定量分析 采用二步法免疫組織化學(xué)染色顯示胎盤細(xì)胞PCNA的表達(dá)，一抗?jié)舛?:100，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片。以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色或褐色顆粒為陽性反應(yīng)。定量分析:應(yīng)用MiVnt圖像分析系統(tǒng)，每張切片隨機(jī)選取5個高倍視野(×400），計(jì)算陽性產(chǎn)物面積占分析面積的比值，取平均值作為PCNA蛋白表達(dá)的相對水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件行單因素方差分析，組間比較采用q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 胎盤的形態(tài)結(jié)構(gòu) 對照組胎盤可觀察到組織學(xué)分帶，結(jié)構(gòu)無紊亂;各葉酸組大鼠胎盤組織結(jié)構(gòu)與對照組比較無明顯改變。

2.2 胎盤細(xì)胞PCNA的表達(dá) 各組孕鼠胎盤均可見PCNA陽性表達(dá)，尤其是滋養(yǎng)層細(xì)胞PCNA的表達(dá)最為明顯，陽性產(chǎn)物為棕黃色顆粒狀分布于細(xì)胞核中。定量分析結(jié)果見附表:葉酸3個干預(yù)組胎盤細(xì)胞PCNA的表達(dá)明顯高于對照組(P＜0.05）;不同劑量葉酸組之間比較，大、中劑量組明顯高于小劑量組(P＜0.05）;大、中劑量組之間比較無顯著差異(P＞0.05）。

附表 各組孕鼠胎盤細(xì)胞PCNA的表達(dá)(±s）

附表 各組孕鼠胎盤細(xì)胞PCNA的表達(dá)(±s）

與對照組比較:*P＜0.05;與葉酸小劑量組比較:#P＜0.05

組別 n PCNA表達(dá)對照組 10 8.52±2.5葉酸大劑量組 10 25.1±9.3*#葉酸中劑量組 10 28.3±6.5*#葉酸小劑量組 10 16.2±5.2*

3 討論

葉酸是體內(nèi)生化反應(yīng)中一碳單位的載體，主要參與DNA和RNA的合成，與細(xì)胞增殖密切相關(guān)。細(xì)胞增殖是胎盤和胚胎生長發(fā)育過程中的重要事件，反映胎盤和胚胎細(xì)胞增殖狀況的指標(biāo)很多，如PCNA、ki67等，其中PCNA是僅在增殖細(xì)胞核內(nèi)合成或表達(dá)的蛋白，其表達(dá)量的高低可反映細(xì)胞增殖的活躍程度。正常分裂增殖的細(xì)胞,G0-G1早期細(xì)胞沒有明顯的PCNA表達(dá),G1晚期PCNA的表達(dá)明顯增加,S期達(dá)到高峰,G2、M期下降。

本研究發(fā)現(xiàn)，葉酸干預(yù)組胎盤細(xì)胞PCNA的表達(dá)明顯高于對照組，說明葉酸可上調(diào)PCNA的表達(dá)，表明葉酸具有促進(jìn)胎盤細(xì)胞增殖的作用，并可影響細(xì)胞周期的進(jìn)程。Klingler等[2]的研究發(fā)現(xiàn)，大鼠孕期葉酸飲食可增加胎盤重量、促進(jìn)胎盤發(fā)育，同本研究結(jié)果一致。有學(xué)者研究證實(shí)[3]，葉酸以及葉酸代謝物可引起結(jié)腸癌細(xì)胞株細(xì)胞周期的變化，使癌細(xì)胞S期細(xì)胞數(shù)增加，G2/M期細(xì)胞數(shù)減少，與我們的研究結(jié)果一致。說明葉酸可能對胎盤細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞具有類似的作用，通過改變細(xì)胞周期使S期細(xì)胞數(shù)增多，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。

肖文林等[4]利用RNA干擾技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的葉酸對胚胎腭突細(xì)胞(MEPM)增殖作用的影響不同，葉酸濃度對細(xì)胞的增殖程度在一定范圍內(nèi)具有劑量依賴性。本研究也顯示了不同劑量葉酸組PCNA表達(dá)的差異性，提示葉酸促進(jìn)細(xì)胞增殖的效應(yīng)與劑量有關(guān)。Pickell等[5]的研究發(fā)現(xiàn)，葉酸攝入過高可能干擾鼠胚胎發(fā)育，導(dǎo)致胎鼠發(fā)育遲緩、胎鼠缺陷、死胎等妊娠結(jié)局。因此推測，葉酸劑量過大可能會抑制細(xì)胞增殖。

綜上所述，給受孕大鼠灌服一定劑量的葉酸，可提高胎盤細(xì)胞PCNA的陽性表達(dá)，促進(jìn)胎盤細(xì)胞增殖，有助于胎盤發(fā)育。有關(guān)葉酸、PCNA及細(xì)胞增殖之間的量效關(guān)系及確切作用途徑，有待于深入研究。

[1]Grossi F,Loprevite M,Chiaramondia M,et al.Prognostic significance of K-ras, p53, bcl-2, PCNA,CD34 in radically resected non-small cell lung cancers[J].Eur J Cancer,2003,39(9):1242-1250.

[2]Klingler M, Blaschitz A, Campoy C,et al.The effect of docosahexaenoic acid and folic acid supplementation on placental apoptosis and proliferation[J].Br J Nutr,2006, 96(1):182-190.

[3]Mathers JC.Reversal of DNA hypomethylation by folic acid supplements:possible role in colorectal cancer prevention[J].Gut,2005,54(5): 579-581.

[4]肖文林，石冰，鄭謙，等.葉酸拮抗亞甲基四氫葉酸還原酶基因沉默的實(shí)驗(yàn)研究[J].實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志,2010,26(1):15-19.

[5]Pickell L, Brown K,Li D,et al.High intake of folic acid disrupts embryonic development in mice[J].Birth Defects Res A Clin Mol Teratol, 2011, 91(1): 8-19.