薛秋紅 何堅(jiān) 陳佳 吳翔磊 龔樹(shù)生 謝靜

研究表明，噪聲首先損傷柯替器的外毛細(xì)胞，從耳蝸底回開(kāi)始，進(jìn)行性向蝸?lái)敯l(fā)展，可進(jìn)一步累及內(nèi)毛細(xì)胞、支持細(xì)胞、耳蝸血管紋甚至螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞[1]。耳蝸的損害存在兩種類型的細(xì)胞死亡—即凋亡和壞死[2]，本實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞核熒光染色方法，觀察強(qiáng)噪聲暴露后不同時(shí)期豚鼠耳蝸毛細(xì)胞死亡的不同方式，為其不同的時(shí)期干預(yù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選用健康白色紅目雄性豚鼠48只，體重400～450 g，耳廓反射靈敏，鼓膜完整，無(wú)中耳炎，無(wú)藥物、噪聲接觸史。隨機(jī)分為健康對(duì)照組(8只)和實(shí)驗(yàn)組(40只)，實(shí)驗(yàn)組又分為噪聲暴露后3 h、1 d、4 d、14 d、30 d組，每組8只。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1噪聲暴露 噪聲由軟件4 kHz NBN-316 Hz BW-50 mV(北京解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉研究所自制并惠贈(zèng)) 經(jīng)筆記本電腦聲卡產(chǎn)生，經(jīng)放大器放大傳至揚(yáng)聲器，揚(yáng)聲器置于80 cm×80 cm×85 cm的雙層隔音箱四角；實(shí)驗(yàn)組豚鼠置于35 cm×35 cm×50 cm的飼養(yǎng)籠中，自由進(jìn)水，豚鼠活動(dòng)范圍內(nèi)聲強(qiáng)相差最大不超過(guò)5 dB。用HS6280型噪聲頻譜分析儀(中國(guó)江西國(guó)營(yíng)紅聲器材廠)連續(xù)監(jiān)測(cè)，噪聲為中心頻率4 kHz的窄帶噪聲，聲級(jí)計(jì)測(cè)量噪聲強(qiáng)度，給聲強(qiáng)度為120 dB SPL,暴露時(shí)間為4 h。對(duì)照組正常飼養(yǎng)不作任何處理。

1.2.2聽(tīng)性腦干反應(yīng)(ABR)測(cè)試：正常對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組豚鼠在噪聲暴露前及噪聲暴露后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死前，以10%水合氯醛(30 mg/kg)腹腔麻醉，在靜電屏蔽室內(nèi)測(cè)試ABR。采用Nicolet Compass 系統(tǒng),刺激聲為click，重復(fù)率為20次/秒, 掃描周期為10 ms，濾波帶寬100～3 000 Hz，信號(hào)疊加1 024次，以引出可重復(fù)波Ⅲ的最小刺激聲強(qiáng)度為標(biāo)準(zhǔn)判斷反應(yīng)閾。

1.2.3耳蝸基底膜鋪片、Hoechst33342熒光染色 各組豚鼠于全身麻醉狀態(tài)下完成ABR測(cè)試后，快速斷頭處死，取雙側(cè)聽(tīng)泡，開(kāi)放卵圓窗和圓窗，灌注4%多聚甲醛磷酸緩沖液后，將聽(tīng)泡置于4%多聚甲醛磷酸緩沖液2 h，去蝸殼，分離耳蝸基底膜；應(yīng)用DNA熒光染料Hoechst33342進(jìn)行細(xì)胞核染色。將分離的基底膜置于染色液中，室溫避光染色10 min后10 mmol/L BPS清洗標(biāo)本3次，染色后的基底膜鋪片，50%甘油封片。共聚焦熒光顯微鏡觀察毛細(xì)胞核的變化并計(jì)數(shù)；觀察全耳蝸基底膜，選擇受損最明顯的一段基底膜(距蝸尖約9～14 mm處，長(zhǎng)約6 mm)，定量觀察受損的外毛細(xì)胞，并分別計(jì)數(shù)凋亡、壞死和缺失數(shù)目的百分比。 Hoechst33342染色顯示核固縮、核碎裂是細(xì)胞凋亡的特征，核腫脹是細(xì)胞壞死的特征，在正常的毛細(xì)胞排列處出現(xiàn)空缺為毛細(xì)胞缺失。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 各組計(jì)量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1各組ABR反應(yīng)閾 對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組噪聲暴露前后ABR平均反應(yīng)閾見(jiàn)表1，可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組噪聲暴露后各組與對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組噪聲暴露前ABR閾值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．01),噪聲暴露后3 h、1 d組與噪聲暴露后其他組ABR閾值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．01)，但噪聲暴露后4 d、14 d、30 d組間差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)的噪聲條件可以引起豚鼠聽(tīng)力永久性閾移，噪聲暴露后3 h閾移達(dá)到高峰，4 d后基本穩(wěn)定。

注：*與對(duì)照組及同組噪聲暴露前相比，P<0.01；△與噪聲暴露后4、14、30 d組相比，P<0.01

2.2共聚焦熒光顯微鏡下觀察 正常對(duì)照組毛細(xì)胞核為淡藍(lán)色，大小一致，三排外毛細(xì)胞及一排內(nèi)毛細(xì)胞排列整齊。噪聲刺激后3 h、1 d、4 d、14 d、30 d組外毛細(xì)胞排列紊亂，內(nèi)、外毛細(xì)胞均呈現(xiàn)3種病理改變：①核腫脹：細(xì)胞核體積增大，熒光染色減弱；②核固縮：細(xì)胞核體積縮小，熒光染色增強(qiáng)；③核消失：在原細(xì)胞核位置出現(xiàn)空白區(qū)。根據(jù)Hoechst33342染色判斷標(biāo)準(zhǔn),這三種核改變分別是細(xì)胞發(fā)生壞死、凋亡和缺失的改變。各種毛細(xì)胞核的病理改變多見(jiàn)于第一排外毛細(xì)胞,其次為第二、第三排，內(nèi)毛細(xì)胞核受損較少。毛細(xì)胞核形態(tài)學(xué)改變累及耳蝸基底膜各回,主要為底回末端和第二回起始區(qū)域(距蝸尖約9～14 mm處，長(zhǎng)約6 mm)(圖1)。

圖1 各組耳蝸基底膜鋪片(Hochest33342染色×400)

2.3損傷的外毛細(xì)胞定量分析 在噪聲暴露后總的趨勢(shì)是缺失的外毛細(xì)胞逐漸增加，壞死和凋亡的細(xì)胞數(shù)逐漸減少，總的損傷外毛細(xì)胞數(shù)(壞死、凋亡、缺失)明顯增加。凋亡和壞死的細(xì)胞數(shù)在不同的時(shí)間點(diǎn)不同，噪聲暴露后3 h、1 d、4 d組凋亡的平均細(xì)胞數(shù)百分比明顯多于壞死(P<0.05)，噪聲暴露后14 d組凋亡與壞死的細(xì)胞數(shù)百分比沒(méi)有明顯差異(P>0.05),噪聲暴露后30 d組凋亡細(xì)胞少于壞死細(xì)胞(P<0.05)(表2)。

表2 實(shí)驗(yàn)各組豚鼠外毛細(xì)胞凋亡、壞死占受損細(xì)胞總數(shù)百分比

注：與同組壞死的平均細(xì)胞百分?jǐn)?shù)相比，*P<0.05

3 討論

研究表明，強(qiáng)噪聲刺激后，耳蝸內(nèi)細(xì)胞壞死和凋亡是同時(shí)發(fā)生的[2]。細(xì)胞的死亡方式與線粒體能量代謝相關(guān)，細(xì)胞內(nèi) ATP水平保持在一定的閾值以上時(shí), 細(xì)胞以調(diào)亡方式死亡，而 ATP水平在閾值之下時(shí), 細(xì)胞以壞死方式死亡[ 3]。Hoechst為核酸特異性染料，能區(qū)分凋亡和壞死細(xì)胞，凋亡細(xì)胞發(fā)生染色質(zhì)濃縮或核碎裂，染色后熒光顯微鏡下表現(xiàn)為胞核致密濃染或碎塊樣致密濃染，而壞死細(xì)胞表現(xiàn)為核腫脹，熒光變淡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，在噪聲刺激后基底膜鋪片Hoechst33342熒光染色顯示內(nèi)、外毛細(xì)胞均呈現(xiàn)核腫脹、核固縮和核消失3種病理改變，外毛細(xì)胞比內(nèi)毛細(xì)胞損害嚴(yán)重，外毛細(xì)胞損害主要表現(xiàn)在底回和第二回，且多為第一排和第二排，與HU等[2]報(bào)道基本一致。同時(shí)實(shí)驗(yàn)組受損的細(xì)胞愈近底回愈多，愈近頂回則愈少，耳蝸的基底回末段及第二回開(kāi)始處病變最明顯，可能是由于此處接近鼓室，容易受噪聲影響，且該部位主要感受4 kHz的聲音，本實(shí)驗(yàn)所給噪聲的中心頻率為4 kHz，故此處損害最明顯。噪聲可造成耳蝸局部缺血再灌注及細(xì)胞膜微小損傷，導(dǎo)致谷氨酸、NO、ROS(活性氧)形成，其中ROS的產(chǎn)生和耳蝸中抗氧化防御系統(tǒng)的改變對(duì)耳蝸細(xì)胞的損傷起到了主要作用[4]。許多實(shí)驗(yàn)證明NO、ROS可直接誘導(dǎo)體內(nèi)、外各種組織的氧化損傷和細(xì)胞凋亡，因此推測(cè)噪聲刺激導(dǎo)致耳蝸內(nèi)NO、ROS的水平增高，并可能激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)途徑和調(diào)控基因表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)耳蝸細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)中，強(qiáng)噪聲暴露后30天，耳蝸還同時(shí)存在3種核形態(tài)變化，據(jù)此推論強(qiáng)噪聲暴露后毛細(xì)胞的損傷是一個(gè)復(fù)雜的長(zhǎng)期非同步的病理變化過(guò)程，且耳蝸的損傷至少持續(xù)到噪聲暴露后30天。

從文中結(jié)果看，實(shí)驗(yàn)組噪聲暴露后總的趨勢(shì)是缺失的外毛細(xì)胞明顯增加，壞死和凋亡的細(xì)胞數(shù)減少，噪聲暴露后3 h、1 d、4 d組凋亡的細(xì)胞數(shù)明顯多于壞死(P<0.05)，噪聲暴露后14 d組凋亡與壞死的細(xì)胞數(shù)沒(méi)有明顯差異(P>0.05)，噪聲暴露后30 d組凋亡的細(xì)胞數(shù)明顯少于壞死(P<0.05)。由此推論, 強(qiáng)噪聲暴露后的早期,細(xì)胞能量代謝系統(tǒng)輕度受損,毛細(xì)胞死亡方式以凋亡為主；到中晚期一些細(xì)胞內(nèi)ATP含量嚴(yán)重減少,細(xì)胞死亡以壞死為主。凋亡不僅發(fā)生在強(qiáng)噪聲對(duì)豚鼠耳蝸損害的早期，而且至少一直持續(xù)到噪聲暴露后30天。這可能與強(qiáng)噪聲除對(duì)內(nèi)耳直接作用外，還會(huì)發(fā)生次級(jí)損傷有關(guān)，即高強(qiáng)度噪聲后產(chǎn)生大量自由基，自由基損傷DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等，導(dǎo)致毛細(xì)胞的凋亡和壞死[5,6]。噪聲暴露后30天總的損傷外毛細(xì)胞數(shù)(壞死、凋亡、缺失)明顯上升，這與豚鼠噪聲暴露后聽(tīng)力損失結(jié)果并不矛盾，因?yàn)殡S著噪聲停止刺激后時(shí)間的延長(zhǎng)，大量損害不嚴(yán)重的毛細(xì)胞在各種細(xì)胞保護(hù)機(jī)制的作用下會(huì)逐漸恢復(fù)[7]，因此聽(tīng)力也逐漸恢復(fù)，而本研究統(tǒng)計(jì)的總的損傷細(xì)胞數(shù)是不可逆的細(xì)胞病理改變，只是損傷細(xì)胞的一部分。至于噪聲誘導(dǎo)耳蝸細(xì)胞凋亡與聽(tīng)力損失的具體相關(guān)性，以及凋亡的途徑和分子調(diào)控機(jī)制，還需進(jìn)一步的研究。

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