吳永翔 朱國霞# 劉新秦 米文娟 劉順利 盧連軍

研究表明噪聲可以引起血迷路屏障的改變，從而造成耳蝸內(nèi)環(huán)境改變(如內(nèi)耳內(nèi)外淋巴液滲透壓、離子濃度或/和代謝機(jī)制失衡)，這與噪聲導(dǎo)致聽力損失的機(jī)制有關(guān)[1]。而血迷路屏障(blood-labyrinth barrier,BLB)是存在于血液和內(nèi)耳迷路之間的具有選擇通透性的一種生理屏障系統(tǒng)，其作用在于保持迷路成分的相對(duì)穩(wěn)定，維持內(nèi)耳微環(huán)境的平衡，從而保證內(nèi)耳功能的正常[2，3]，它主要由耳蝸外側(cè)壁血管紋、螺旋韌帶處連續(xù)無窗的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞,邊緣細(xì)胞之間和基底細(xì)胞之間的致密閉鎖帶以及蝸軸細(xì)胞間的緊密連接復(fù)合體構(gòu)成[4]。而血管紋毛細(xì)血管是血迷路屏障重要的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)，其血管內(nèi)皮細(xì)胞接觸面近管腔側(cè)和邊緣細(xì)胞之間均為緊密連接(tight junction,TJ),此外微血管的周細(xì)胞也通過緊密連接包繞血管內(nèi)皮細(xì)胞[5]。

緊密連接結(jié)構(gòu)中的核心部分是TJ相關(guān)蛋白，它包括咬合蛋白o(hù)ccludin、閉合蛋白claudins、連接粘附分子(junctional adhesion moleculos,JAM)，以及閉合小環(huán)蛋白(ZO-1等)，其中閉合蛋白claudins家族可以與其它連接蛋白形成致密的緊密連接復(fù)合體，從而保證血迷路屏障的結(jié)構(gòu)與功能，其表達(dá)具有組織特異性，大多數(shù)組織表達(dá)多種claudins[6]。有研究指出claudin-5在內(nèi)耳血管紋邊緣細(xì)胞和基底細(xì)胞之間表達(dá)均為陰性[7]，但其微血管內(nèi)皮細(xì)胞之間是否存在claudin-5表達(dá)卻鮮有報(bào)道。

本文擬觀察噪聲對(duì)豚鼠BLB中TJ及緊密連接蛋白claudin-5表達(dá)的影響，以期為臨床噪聲性聾的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及噪聲性聾模型的建立 40只健康成年雄性白化豚鼠，體重250～350 g, 耳廓反射靈敏，鼓膜完好(由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(20只)和噪聲暴露組(20只)，正常對(duì)照組不予噪聲暴露，噪聲暴露組給予聲強(qiáng)為115 dB SPL白噪聲暴露，每天6小時(shí)，連續(xù)兩天，噪聲暴露期間，豚鼠均能自由活動(dòng)和飲食飲水，與正常對(duì)照組豚鼠無異。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1聽性腦干反應(yīng)(ABR)檢測 將各組豚鼠置于屏蔽隔聲室內(nèi)，用ABR檢測儀(Bio-logic Systems，美國)檢測雙耳反應(yīng)閾值。豚鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉鹽40 mg/kg麻醉，記錄電極置于顱頂正中皮下，參考電極置于測試耳耳后皮下，接地電極置于鼻尖。采用click聲刺激，頻率13次/秒，由TDH49耳機(jī)輸出，掃描時(shí)間為10 ms，濾波范圍100～3 000 Hz，疊加256次，以波Ⅲ為標(biāo)準(zhǔn)判斷反應(yīng)閾。檢測過程中保持豚鼠體溫恒定。各組于實(shí)驗(yàn)前、噪聲暴露后次日行ABR檢測，檢測完后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2基底膜鋪片F(xiàn)ITC鬼筆環(huán)肽染色 每組豚鼠各取2只，快速斷頭取雙側(cè)聽泡，圓窗、蝸尖刺開，4%多聚甲醛體外灌流，同樣固定液固定2小時(shí)后，于體視顯微鏡下行基底膜全層剝離；將標(biāo)本放入1%正常胎牛血清白蛋白封閉30分鐘，F(xiàn)ITC鬼筆環(huán)肽(Enzo，德國，1：50)孵育30分鐘(避光)，再用0.01 M PBS漂洗，鋪片、甘油封片，顯微鏡(OLYMPUS BX-5,日本)下觀察并照相。于基底膜底回三排外毛細(xì)胞處放大400倍，連續(xù)抽取5個(gè)視野進(jìn)行外毛細(xì)胞計(jì)數(shù)并測量該視野下外毛細(xì)胞所占基底膜的面積，計(jì)算出單位面積外毛細(xì)胞數(shù)(外毛細(xì)胞數(shù)/外毛細(xì)胞所占基底膜面積)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，如視野周邊出現(xiàn)不完整的細(xì)胞則只記一邊。

1.2.3硝酸鑭透射電鏡和常規(guī)透射電鏡標(biāo)本制備與觀察 每組豚鼠各取2只，用新鮮配制好的硝酸鑭-二甲胂酸鈉固定液體內(nèi)灌注充分后(目的在于檢測血迷路屏障通透性)，斷頭取雙耳聽泡。置入固定液后于4 ℃冰箱保存至少24小時(shí)，常規(guī)透射電鏡標(biāo)本則用2.5%戊二醛經(jīng)蝸尖和圓窗膜體外灌流固定液固定2小時(shí)；固定好的標(biāo)本經(jīng)洗液漂洗4小時(shí)，于體視顯微鏡下取出耳蝸血管紋后，用1%鋨酸固定2小時(shí)，梯度丙酮脫水，按照每回上半回、下半回的順序放入平板中Epon812定向包埋。制作半薄切片、染色、定位后，超薄切片、鈾染、鉛染、滴網(wǎng)后，透射電鏡觀察。

1.2.4Western blot 檢測 各組豚鼠取12只迅速斷頭，分別取出雙側(cè)聽泡和眼球，于體視顯微鏡下迅速取出耳蝸外側(cè)壁血管紋和視網(wǎng)膜后，將組織凍存于-80 ℃冰箱待測，整個(gè)取材過程均置于冰上或冰水中操作。

提取組織蛋白前，先將凍存于-80℃冰箱的兩組血管紋和視網(wǎng)膜組織標(biāo)本稱重后，分別放入標(biāo)記好的勻漿器中，加入事先配好的組織裂解液，冰上充分勻漿，12 000 rpm，4 ℃，離心10分鐘，收集上清液后，所得即為制備好的蛋白樣品。吸取少量的蛋白樣品，按1：20稀釋成工作液后，用BCA法進(jìn)行蛋白定量。按每個(gè)泳道5 μg加載于SDS-PAGE凝膠電泳孔中，用恒壓120 V/40 mA電泳至溴酚藍(lán)位于凝膠底邊，再用恒流300 mA轉(zhuǎn)印于NC膜上。麗春紅染色，TBST緩沖液配置的50 g/L脫脂奶粉室溫下封閉2小時(shí)，然后加入兔抗豚鼠claudin-5一抗及兔抗GAPDH(Santa Cruz,美國，1：200)，4 ℃過夜，TBST緩沖液洗膜2次，每次10分鐘，再用TBS緩沖液洗膜1次，10分鐘，加入HRP標(biāo)記的二抗(Invitrogen，美國，1：5 000 )，37 ℃孵育1小時(shí)，洗膜3次，每次10分鐘；然后ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測claudin-5及GAPDH的蛋白表達(dá)水平。用蛋白marker分析陽性條帶的分子量大小，并用TANON高清晰度計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描分析，檢測分析目的蛋白的表達(dá)量。其中視網(wǎng)膜組織為陽性對(duì)照，claudin-5抗體可識(shí)別相應(yīng)的蛋白，GAPDH作為內(nèi)參，分別于Mr 24KD和36KD出現(xiàn)陽性條帶，灰度掃描軟件系統(tǒng)分析。

1.2.5免疫組織化學(xué)染色 每組各取2只豚鼠，用新鮮配制的4%多聚甲醛體內(nèi)灌注充分后，斷頭取雙側(cè)聽泡。再刺開蝸尖和圓窗膜，用4%多聚甲醛分別從蝸尖和圓窗膜灌流數(shù)次，置入固定液后于4 ℃冰箱保存至少24小時(shí)；10%EDTA脫鈣兩周，置于30%蔗糖浸泡24小時(shí)；OCT膠包埋，平行蝸軸以10 μm為厚度連續(xù)冰凍切片后，室溫過夜晾干。切片先用0.01 M PBS洗片數(shù)次，再用0 .3%甲醇雙氧水浸泡放置于37 ℃濕盒，10分鐘，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，用0.01 M PBS洗片，滴加羊血清抗體封閉液(Jackson Immunoresearch Lab, 美國)37 ℃封閉30分鐘；然后滴加一抗兔抗豚鼠多克隆抗體(Santa Cruz,美國，1：200)；正常組和噪聲暴露組分別設(shè)陰性對(duì)照組，陰性對(duì)照組均加入0.01 M PBS 替代一抗，4 ℃過夜。0.01 M PBS洗片數(shù)次，滴加生物素化羊抗兔IgG(即用型)，37 ℃孵育30分鐘；0.01 M PBS洗片后，滴加SABC，37 ℃，30分鐘；洗片后加入新鮮配制的0.05%DAB和0.03%雙氧水混合液顯色2～5分鐘，蒸餾水終止，0.01 M PBS洗片；經(jīng)蘇木素復(fù)染核后，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，樹膠封片。待干燥后顯微鏡下觀察。

光鏡下，血管紋邊緣細(xì)胞層、基底細(xì)胞層、微血管內(nèi)皮細(xì)胞間和管周，以及螺旋韌帶微血管處的棕黃色顆粒均為陽性著色。其染色結(jié)果采用灰密度分析法，通過在不同組別的組織切片上選擇相同區(qū)域、相同條件下用Image J軟件進(jìn)行光密度分析后，將所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或One-way ANOVA方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1兩組豚鼠ABR反應(yīng)閾 噪聲暴露組豚鼠噪聲暴露前后ABR波Ⅲ反應(yīng)閾分別為17.08±2.52和61.88±10.41 dB SPL，其閾移超過40 dB，噪聲暴露前后ABR反應(yīng)閾比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；正常對(duì)照組為19.17±2.82 dB SPL，噪聲暴露后兩組反應(yīng)閾差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明造模成功。

2.2兩組耳蝸基底膜FITC染色結(jié)果 正常對(duì)照組外毛細(xì)胞排列整齊，纖毛方向一致呈V或W型，而噪聲暴露組可見基底膜毛細(xì)胞大量缺失，纖毛排列紊亂，出現(xiàn)倒伏或融合消失(圖1)。正常組和噪聲暴露組基底膜底回單位面積外毛細(xì)胞數(shù)分別為(5.83±0.22)×103、(4.07±0.26)×103個(gè)/mm2，后者明顯少于前者(P<0.05)。

2.3透射電鏡觀察結(jié)果 常規(guī)透射電鏡觀察可見，噪聲暴露組噪聲暴露后血管紋結(jié)構(gòu)紊亂，組織細(xì)胞有不同程度的變性水腫和壞死，微血管管腔變形，管壁基膜電子密度降低并出現(xiàn)復(fù)層化，腔內(nèi)有大量膜性結(jié)構(gòu)；同時(shí)，血管紋微血管內(nèi)皮細(xì)胞之間和邊緣細(xì)胞之間的緊密連接均有破壞和松解，細(xì)胞間雙層結(jié)構(gòu)消失，連接松散并間隙增大；而正常組血管紋結(jié)構(gòu)正常(圖2)。

圖1 豚鼠基底膜鋪片F(xiàn)ITC染色(Scale bar: 20 μm)

圖2 正常組和噪聲暴露組豚鼠耳蝸血管紋常規(guī)透射電鏡結(jié)果(箭頭所示處為細(xì)胞間緊密連接)

硝酸鑭透射電鏡下可見正常組鑭顆粒均局限于微血管管腔內(nèi)，部分內(nèi)皮細(xì)胞間向管腔面可見少量鑭顆粒但其均未穿過緊密連接；而噪聲暴露組鑭顆粒穿過受損的內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接，大量沉積于微血管基膜的內(nèi)外兩側(cè)和管腔外的中間細(xì)胞層(圖3)。

圖3 正常組和噪聲暴露組豚鼠耳蝸血管紋微血管硝酸鑭透射電鏡結(jié)果(箭頭所示處為鑭顆粒滲透沉積部位)

a: 正常組鑭顆粒大多位于微血管管腔內(nèi)壁，未穿過內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接；b: 噪聲暴露組大量鑭顆粒穿透受損的緊密連接，沉積于微血管基膜的兩側(cè)和微血管管腔外的中間細(xì)胞層

2.4兩組血管紋緊密連接蛋白claudin-5的表達(dá)

Western blot結(jié)果分析示：兩組血管紋中claudin-5均有較高表達(dá)，但噪聲暴露組表達(dá)水平較正常組明顯降低；而在陽性對(duì)照的視網(wǎng)膜中，兩組claudin-5的表達(dá)并無明顯不同(圖4)。

2.5兩組耳蝸免疫組織化學(xué)染色光鏡觀察結(jié)果

圖5 正常組和噪聲暴露組豚鼠耳蝸外側(cè)壁中claudin-5的免疫組織化學(xué)染色(SABC×400)(Scale bar:100 μm)

正常組耳蝸血管紋毛細(xì)血管內(nèi)皮、邊緣細(xì)胞層、基底細(xì)胞層和螺旋韌帶毛細(xì)血管內(nèi)皮均有較強(qiáng)的棕黃色陽性顆粒著色；而噪聲暴露組以上部位雖也有棕黃色顆粒著色，但染色深度較正常組明顯淺。經(jīng)圖像采集分析系統(tǒng)軟件分析各組免疫組化染色光密度值，結(jié)果示噪聲組的光密度值[(23.50±0.74)×10-3]較正常組[(74.10±7.04)×10-3]明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組陰性對(duì)照的耳蝸外側(cè)壁處均未發(fā)現(xiàn)免疫信號(hào)(圖5)。

3 討論

噪聲性聾的發(fā)生可能與機(jī)械損傷、氧化還原狀態(tài)失衡、氧自由基損傷、微循環(huán)障礙、鈣鎂離子平衡失調(diào)、谷氨酸興奮性中毒、毛細(xì)胞凋亡等因素有關(guān)[8.9]。耳蝸微血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性正常對(duì)于維持內(nèi)耳微環(huán)境的穩(wěn)定極其重要，這對(duì)BLB功能意義重大，它同時(shí)也是內(nèi)耳內(nèi)淋巴液保持高K+、低Na+的前提。研究表明血迷路屏障的破壞與噪聲性聾密切相關(guān)，耳蝸微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高參與了噪聲所致的早期聽力損失[10]。本研究采用硝酸鑭透射電鏡和常規(guī)透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)噪聲破壞了豚鼠耳蝸血管紋處的緊密連接，使細(xì)胞間隙增大；正常情況下位于微血管管腔內(nèi)的鑭顆粒，通過受損的細(xì)胞間緊密連接，進(jìn)入到微血管基膜內(nèi)外兩側(cè)和中間細(xì)胞層中，表明噪聲通過破壞細(xì)胞間的緊密連接，增加了BLB通透性。

正常耳蝸微血管內(nèi)皮細(xì)胞間廣泛存在的緊密連接保證了BLB的高選擇通透性和內(nèi)外淋巴液的正常循環(huán)，而緊密連接蛋白的高表達(dá)是內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)；其中claudins對(duì)于屏障功能的維持和通透性的調(diào)節(jié)起著尤為突出的作用，它可以通過不同的信號(hào)通路，使自身蛋白發(fā)生磷酸化、去磷酸化或下調(diào)自身蛋白表達(dá)來實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)屏障通透性的作用。claudins蛋白家族由24個(gè)跨膜蛋白亞型組成，分子量為20～27 kD,表達(dá)具有組織特異性，不同的claudin蛋白之間、claudin與occludin之間均能形成緊密連接復(fù)合物，從而發(fā)揮其功能[11～13]。claudin-5是緊密連接蛋白claudins家族中的一員，廣泛存在于各種組織屏障中，它對(duì)緊密連接微環(huán)境極其敏感，并可通過與其它緊密連接蛋白相互作用，改變屏障的通透性。claudin-5在腦微血管循環(huán)內(nèi)皮系統(tǒng)中表達(dá)豐富。研究認(rèn)為claudin-5是腦血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的最重要的調(diào)節(jié)因子，對(duì)血腦屏障通透性可能起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用[14，15]。大鼠腦缺血后，其血腦屏障可出現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶介導(dǎo)的緊密連接蛋白claudin-5下調(diào)[16]。

本研究通過Western blot染色分析，發(fā)現(xiàn)正常豚鼠耳蝸血管紋緊密連接蛋白claudin-5與視網(wǎng)膜相比有較高的表達(dá)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)噪聲可以下調(diào)其表達(dá)。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，正常豚鼠耳蝸外側(cè)壁血管紋毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、邊緣細(xì)胞、基底細(xì)胞和螺旋韌帶毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞處claudin-5免疫反應(yīng)強(qiáng)陽性，噪聲可以導(dǎo)致豚鼠耳蝸外側(cè)壁血管紋上述細(xì)胞claudin-5免疫反應(yīng)降低。進(jìn)一步證實(shí)噪聲負(fù)性調(diào)節(jié)了緊密連接蛋白claudin-5的表達(dá)。

因此，推測噪聲可能激活了某些未知的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，致使緊密連接蛋白表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞間的緊密連接破壞，進(jìn)而引起血迷路屏障通透性增加，誘發(fā)一系列的病理性損害，如內(nèi)耳內(nèi)外淋巴液滲透壓、離子濃度改變、代謝機(jī)制失衡等，從而導(dǎo)致噪聲性聽力損失。本研究結(jié)果提示緊密連接蛋白claudin-5的表達(dá)下調(diào)可能在噪聲所致的BLB通透性改變中發(fā)揮一定作用，但其確切作用還有待于進(jìn)一步的研究。

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