方海田，周運佼，謝希賢，陳 寧

(1. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2. 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021)

大腸桿菌ATCase抗反饋抑制突變體的構(gòu)建及其對胞苷積累的影響

方海田1,2，周運佼1，謝希賢1，陳 寧1

(1. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2. 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021)

為解決胞苷生物合成途徑中天冬氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶受胞苷三磷酸反饋抑制調(diào)節(jié)的問題，通過對其堿基序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析，利用基因定點突變的方法構(gòu)建了大腸桿菌的 ATCase突變酶，得到三個突變體：M1(H20L)、M2(K60E)、M3(K94E)，并在E. coli DH5α中對融合蛋白進行了表達(dá).酶活測定表明，M1、M2、M3的ATCase酶相對活性都比野生型M0的高，分別為野生型M0的1.10、1.22和1.37倍，且比活力都有不同程度提高.與含野生型pyrBI基因的 M0相比，含突變型基因的 M1、M2和 M3均對 15,mmol/L的 CTP具有強的抗反饋抑制作用，且 M1、M2和M3的抗CTP反饋抑制作用分別是M0的5.4、6.0和8.5倍.最后將各突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到E. coli Cyt10(Δcdd)中進行發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果表明，與未含突變基因菌株相比，各含突變基因菌株的胞苷積累量均有不同程度的提高，說明 ATCase定點突變使胞苷的合成積累途徑得到了不同程度的強化.

大腸桿菌；胞苷；天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶；定點突變；抗反饋抑制

目前胞苷的生產(chǎn)主要采用發(fā)酵法[1]，利用基因重組技術(shù)構(gòu)建產(chǎn)胞苷的基因工程菌，通過改變發(fā)酵條件積累胞苷，而解除天冬氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶的反饋抑制調(diào)節(jié)作用是發(fā)酵法生產(chǎn)胞苷的關(guān)鍵問題之一.天冬氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶(aspartate transcarbamylase，ATCase，EC 2.1.3.2)是一種調(diào)節(jié)酶，由 pyrBI基因編碼，催化氨甲酰磷酸和天冬氨酸形成氨甲酰天冬氨酸的反應(yīng)[2–3].與哺乳動物 ATCase結(jié)構(gòu)不同，大腸桿菌中該酶由兩個催化亞基和三個調(diào)節(jié)亞基組成，催化亞基為相對分子質(zhì)量3.4×104蛋白質(zhì)的三聚體，調(diào)節(jié)亞基為相對分子質(zhì)量1.7×104蛋白質(zhì)的二聚體，通過蛋白質(zhì)橋與調(diào)節(jié)亞單位互相聯(lián)結(jié)起來[4].pyrB基因編碼催化鏈，pyrI基因編碼調(diào)節(jié)鏈.胞苷三磷酸(cytidine triphosphate，CTP)是其負(fù)調(diào)節(jié)物，ATP是其正調(diào)節(jié)物[4–5]. Shepherdson等[6]發(fā)現(xiàn) ATCase的一個最有效的抑制劑是代謝產(chǎn)物CTP，當(dāng)CTP水平高時，CTP與ATCase結(jié)合，降低CTP合成的速度；反之，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)CTP水平低時，CTP從ATCase上解離，加快CTP合成速度.

E. coliK12的ATCase的CTP的可能結(jié)合位點分別是 Ile12B、His20B、Lys60B、Val91B、Lys94B[7]，如圖1所示.據(jù)此來設(shè)計pyrBI上的突變位點.

圖1 CTP在ATCase上的結(jié)合位點Fig. 1 Binding sites of CTP in ATCase

為解除 CTP對 ATCase的反饋抑制，本研究針對 ATCase上 CTP的結(jié)合位點問題進行研究.在對該酶調(diào)控結(jié)構(gòu)域(R-domain)氨基酸序列同源比較的基礎(chǔ)上，結(jié)合已報道的大腸桿菌全基因組序列和CTP在ATCase上的結(jié)合位點，利用合成寡核苷酸引物實現(xiàn)體外定點突變的方法，將高度保守區(qū)域進行定點突變[8]，期望獲得具有較高催化活性且解除產(chǎn)物CTP反饋抑制的酶.最終對比 CTP結(jié)合位點突變前后的重組大腸桿菌的 ATCase酶活性和胞苷產(chǎn)量，以考察ATCase定點突變對胞苷積累的影響.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌種和培養(yǎng)基

大腸桿菌Escherichia coliK12、E. coli DH5α、E. coli Cyt10(Δcdd)為本實驗室保藏；原核表達(dá)質(zhì)粒pSTV28購自TaKaRa公司.

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 16,g，玉米漿 5,mL，豆餅水解液 25,mL，酵母膏 1,g，檸檬酸三鈉 2,g，MgSO4·7H2O 5,g，KH2PO42,g，F(xiàn)eSO4·7H2O 100,mg，蒸餾水1,000,mL.

1.1.2 試劑、儀器及分析軟件

氨甲酰基磷酸鹽、L–天冬氨酸、胞苷三磷酸，Sigma公司；Pfu聚合酶，F(xiàn)ermentas公司；基因定點突變試劑盒、限制性內(nèi)切酶BamHI、HindⅢ、DpnI、T4,DNA 連接酶、DNA Marker DL10000，大連TaKaRa公司；硅膠模型TM基因組 DNA 提純試劑盒、TianzTMPCR產(chǎn)物(DNA片段)純化試劑盒、硅膠模型TM質(zhì)粒 DNA小量提純試劑盒，北京博邁德公司；Easy Protein Quantitative Kit，北京全式金公司.

PCR儀，Bio-Rad公司；SBA–40B生物傳感儀，山東生物科學(xué)研究所.DNA 序列分析比較采用DNAMAN 2.0軟件，引物設(shè)計采用Primer Premier 5軟件，電泳圖分析采用 Imagemaster TotalLab v1.00軟件.

1.2 實驗方法

1.2.1 重組大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù) NCBI上檢索到的大腸桿菌 K12標(biāo)準(zhǔn)株MG1655的 ATCase基因 pyrBI的核苷酸序列(GenBank：U00096)設(shè)計引物，用于 ATCase基因的克隆和定點突變.以大腸桿菌K12基因組DNA為模板，用引物P1和P2將pyrBI基因擴增出來，以常規(guī)分子克隆手段連入pSTV28載體中，所含抗性標(biāo)記為Cmr，得到重組質(zhì)粒.

1.2.2 重組大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒的定點突變

利用基因定點突變試劑盒(Site-directed Gene Mutagenesis Kit)用于點突變[9].對所構(gòu)建的重組質(zhì)粒進行 PCR.從基因組中克隆出目的基因片段并分別引入突變位點進行質(zhì)粒 PCR.將定點突變后的 pyrBI送華大基因公司進行核苷酸測序.

基因定點突變反應(yīng)體系：Nuclease-Free Water，41,μL；Reaction Buffer(10×)，5,μL；引物(10,μmol/L each)，2,μL；dNTP Mix(10,mmol/L each)，1,μL；待突變模板質(zhì)粒(0.5,μg)，0.5,μL；Pfu DNA Polymerase，0.5,μL.PCR 反應(yīng)條件：預(yù)變性 95,℃ 3,min；變性95,℃ 30,s；退火 60,℃ 30,s；延伸 72,℃ 4.5,min；延伸、補全 72,℃ 10,min；4,℃保持；共 35個循環(huán).PCR反應(yīng)后，加入 1,μL DpnI，混勻后 37,℃孵育 1,h.DpnI消化完畢后可以直接用于轉(zhuǎn)化.

轉(zhuǎn)化、挑克隆鑒定：在100,μL DH5α感受態(tài)細(xì)菌中加入5～10,μL經(jīng)過DpnI消化后的突變產(chǎn)物，冰浴20,min，42,℃熱擊 60,s，冰浴 2,min 后加入 890,μL SOC 培養(yǎng)基，37,℃、180,r/min復(fù)蘇 1,h.在涂板前5,000,r/min離心 1,min，全部均勻地涂布到含有氯霉素的 LB平板上，37,℃培養(yǎng)過夜.進行菌落 PCR，然后先挑單個克隆提取質(zhì)粒，酶切驗證.取 3～5個酶切鑒定正確的克隆測序，以最終確認(rèn)得到的克隆是否是預(yù)期的突變克隆.

1.2.3 野生型及突變型酶基因的誘導(dǎo)表達(dá)及酶活性測定

將重組菌于 37,℃培養(yǎng)至 A600為 0.6～1.0，加入0.1,mmol/L IPTG，收集菌體，經(jīng)超聲破碎后取上清液，以 12% SDS-PAGE鑒定，并測定 ATCase酶活.酶活測定反應(yīng)混合物：50,mmol/L Tris-HCl(pH 7.0)，15,mmol/L L–天冬氨酸，8,mmol/L Na2-CP，加ATCase酶液補足1,mL.28,℃保溫30,min，加熱煮沸終止反應(yīng)，搖勻后 466,nm 比色.酶活力單位定義為：在 28,℃條件下，每分鐘催化生成 1,μmol 產(chǎn)物(氨甲酰天冬氨酸)為一個酶活力單位(U).酶的比活力為酶活力除以蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)所得值，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的檢測參照 Bradford法[10]，利用 Easy Protein Quantitative Kit直接測定.

1.2.4 CTP對 ATCase活性的影響及含突變基因重組子對CTP的抗反饋抑制作用的測定

在測定反應(yīng)體系中分別加入終濃度為 0、0.5、1、2、5、10、15,mmol/L 的 CTP，按標(biāo)準(zhǔn)酶活測定方法測定酶活.以未添加 CTP時酶活力設(shè)為 100%，計算相對活性.

1.2.5 突變體的發(fā)酵培養(yǎng)及對胞苷積累量的測定

將得到的突變質(zhì)粒分別導(dǎo)入到 Escherichia coli Cyt10(Δcdd)中，在 37,℃、200,r/min 條件下進行發(fā)酵培養(yǎng).發(fā)酵培養(yǎng) 40,h后結(jié)束發(fā)酵，采用 HPLC測定反應(yīng)生成的胞苷.

2 結(jié)果與分析

2.1 野生型與突變體大腸桿菌融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

分別將野生型pyrBI基因和突變型pyrBI基因連接到表達(dá)載體 pSTV28上，導(dǎo)入到 DH5α中.然后將大腸桿菌重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子進行驗證，對重組菌進行菌落 PCR，將菌落 PCR 產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測.根據(jù)菌落 PCR的篩選結(jié)果，從每種重組質(zhì)粒的單菌落中挑取菌體培養(yǎng)，取適量培養(yǎng)液，用博邁德公司的質(zhì)粒 DNA小量提取試劑盒提取質(zhì)粒，將提純的質(zhì)粒分別用 BamHI和 HindⅢ進行單酶切反應(yīng)，同時進行雙酶切反應(yīng).對酶切反應(yīng)液用瓊脂糖凝膠電泳檢測反應(yīng)產(chǎn)物，結(jié)果如圖2所示.

圖2 突變體重組質(zhì)粒的雙酶切驗證Fig. 2 DNA electrophoresis of identification of recombined plasmid by digestion with BamHI and HindⅢ

將突變體質(zhì)粒送北京華大基因公司測序.對所得基因進行測序和序列分析表明，ATCase上的His20B已突變?yōu)?Leu20B，Lys60B突變?yōu)?Glu60B，Lys94B突變?yōu)镚lu94B突變的基因，所得ATCase基因序列與設(shè)計的突變相符.

2.2 野生型與突變體大腸桿菌 ATCase的誘導(dǎo)表達(dá)及酶活分析

將重組大腸桿菌M0、M1、M2、M3分別培養(yǎng)，用0.1,mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，然后取菌樣提取粗酶液.進一步測定 ATCase酶活進行驗證可知，重組的基因工程菌經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)后可表達(dá)出相對活性較高的 ATCase，明顯優(yōu)于未轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒的大腸桿菌，結(jié)果如圖3所示.

圖3 不同CTP濃度下野生型與突變型ATCase的反饋抑制作用Fig. 3 Feedback inhibition of ATCase by CTP of the original and mutant on different CTP concentration

突變體的酶活均有升高，分別是野生型的 1.10、1.22、1.37倍.不同突變體的 ATCase的比活力及胞苷產(chǎn)量見表1.突變體M1、M2和M3的比活力分別比野生型M0提高11.2%、20.6%和35.1%.

表1 不同突變體的ATCase的比活力及胞苷產(chǎn)量Tab. 1 ATCase specific activities and cytidine production of different mutants

2.3 野生型和突變型酶蛋白抗CTP反饋抑制比較

對于野生型酶，當(dāng)酶活反應(yīng)體系中的 CTP的濃度達(dá)到 0.5,mmol/L時，就會產(chǎn)生反饋抑制而導(dǎo)致酶活力下降.為了構(gòu)建胞苷的高產(chǎn)菌株，必須使酶對CTP的抗反饋抑制作用達(dá)到一定程度.如圖3所示，野生型 ATCase在 CTP濃度達(dá)到 0.5,mmol/L時，ATCase活性僅存47%；在CTP濃度達(dá)到15,mmol/L時，M0的 ATCase活性僅存 10%，突變體 M3的ATCase活性仍有 85%以上，而突變體M1與 M2的ATCase活性分別為54%和60%；M1、M2和M3與野生型M0相比，M1、M2和M3的抗CTP反饋抑制作用分別是M0的5.4、6.0和8.5倍，對CTP的抗反饋抑制作用也有一定程度的提高.

2.4 野生型與含突變基因重組菌對胞苷產(chǎn)量的影響

對比搖瓶發(fā)酵結(jié)果，以考察含突變后的 pyrBI基因的各突變體大腸桿菌是否去除了 CTP的反饋抑制問題.對比 CTP結(jié)合位點突變前后的重組大腸桿菌M0、M1、M2和M3的胞苷產(chǎn)量.

各突變體菌株產(chǎn)生的胞苷分別為(290±9.17)、(305±4.04)、(445±7.02)mg/L，分別是突變前菌株M0(125±5.57)mg/L 的 2.32、2.44、3.56倍.實驗結(jié)果表明，針對 CTP在 ATCase上的結(jié)合位點進行定點突變有顯著效果，說明突變 pyrBI基因所表達(dá)的ATCase的反饋抑制問題得到了改善，強化了胞苷合成途徑.

3 討 論

ATCase酶催化嘧啶從頭合成途徑中的第二步反應(yīng)，是重要的限速酶.為了獲得抗代謝產(chǎn)物 CTP反饋抑制且保持較高酶催化活性的酶蛋白，本研究采用基因定點突變(site-directed gene mutagenesis)的方法，有目的地構(gòu)建突變體，通過對野生型酶蛋白和突變型酶蛋白性質(zhì)的研究，篩選能較好地保持 ATCase酶的活性且具有抗反饋抑制性質(zhì)的突變體.

由于CTP對ATCase的反饋抑制與調(diào)節(jié)亞基相關(guān)，所以要尋找起關(guān)鍵作用的 CTP結(jié)合位點進行突變，得到 3個突變體，從而實現(xiàn)對酶蛋白的精細(xì)改造，期望可以解除反饋抑制作用.根據(jù)幾種相關(guān)微生物 ATCase調(diào)節(jié)亞基氨基酸序列多重比較的結(jié)果，結(jié)合已有的研究結(jié)果[11]，利用擴增出的未突變和突變pyrBI基因及 pSTV28質(zhì)粒，成功地構(gòu)建了用于大腸桿菌表達(dá)的重組質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)化入 E. coli Cyt10(Δcdd).成功構(gòu)建了 M0(野生型)、M1(H20L)、M2(K60E)、M3(K94E).酶學(xué)性質(zhì)研究表明：幾種突變酶比野生型酶具有較高的抗 CTP反饋抑制的能力，且 ATCase活性均有一定程度的提高.pSTV28質(zhì)粒屬于低拷貝質(zhì)粒，為避免因拷貝數(shù)高導(dǎo)致的高表達(dá)量對發(fā)酵目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)率的對應(yīng)關(guān)系產(chǎn)生影響，故選擇低拷貝數(shù)質(zhì)粒以消除這種影響.表明這些位點可能與酶蛋白與 CTP的結(jié)合或酶的多聚化有關(guān)；突變體酶活性的提高可能與酶易與底物結(jié)合有關(guān)；也可能與因突變導(dǎo)致氨基酸發(fā)生改變從而減弱 CTP在酶上的結(jié)合所需的作用力如氫鍵、離子鍵及疏水作用力有關(guān).

本研究在酶學(xué)性質(zhì)的體外研究基礎(chǔ)上，通過含突變酶基因的重組子進行酶的體內(nèi)活性研究.野生菌中，當(dāng) CTP濃度達(dá)到 5,mmol/L時，會導(dǎo)致酶活力降低.而突變后的酶蛋白不易與 CTP發(fā)生結(jié)合，酶活性不受影響，當(dāng)CTP濃度為15,mmol/L時，含突變基因的菌株都可以旺盛地生長.突變后，各突變體的酶比活力均有不同程度的提高.總之，本研究成功地構(gòu)建了既部分解除了 CTP的反饋抑制又保持了酶催化活性的M1、M2和M3三個酶突變體.

野生型 M0在發(fā)酵培養(yǎng)中胞苷產(chǎn)量和 ATCase抗 CTP反饋抑制效應(yīng)顯著低于突變型 M1、M2和M3，表明突變pyrBI基因所表達(dá)的ATCase的受CTP反饋抑制的問題得到了改善，在未經(jīng)優(yōu)化的條件下通過發(fā)酵培養(yǎng)，使得胞苷的積累量有了一定程度的提高.但是，胞苷的產(chǎn)量并沒有大量積累，可能是胞苷合成途徑中還存在其他負(fù)調(diào)控因素，如 UMP對CPSase和ATCase的反饋抑制，CTP對CTP合成酶的反饋抑制及阻遏等[12–13].解除 CTP反饋抑制突變菌株的成功構(gòu)建為發(fā)酵法生產(chǎn)胞苷過程的深入研究提供了很好的基礎(chǔ).目前，突變體正進一步用于構(gòu)建胞苷的高產(chǎn)菌株的研究中.

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Construction of ATCase Mutants with Feedback Inhibition Resistance and their Effect on the Cytidine Production in E. coli

FANG Haitian1,2，ZHOU Yunjiao1，XIE Xixian1，CHEN Ning1
(1. College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China；2. College of Agriculture，Ningxia University，Yinchuan 750021，China)

In order to obtainE. coliATCase mutants with high catalytic activities and feedback inhibition resistance，sitedirected mutagenesis，homologial analysis of the related amino acid sequences of ATCaseand PCR were used to construct three mutants：M1(H20L)，M2(K60E)，M3(K94E). First，pyrBI gene of M0(wild type)was ligated to plasmid pSTV28 vector，and site-directed mutagenesis was carried out by PCR. The fusion proteins were expressed inE. coliDH5α，and the erzyme activity analysis showed that the original ATCase relative activity of M0 not only remained but also increased by 1.10-fold，1.22-fold and 1.37-fold respectively. Their specific activities were also increased. Measuring of the feedback inhibition resistance of the enzyme showed thatE. coliDH5αstrains containing the mutation gene had a strong feedback inhibition resistance against 15 mmol/L of CTP concentration. The enzymic activities found in M1，M2 and M3 strains were 5.4-，6.0- and 8.5-fold of M0 in CTP feedback inhibition resistance of ATCase regulation. Finally，all mutant plasmids were transformed intoE. coliCyt10(Δcdd). After fermentation，ATCase synthesis of site-directed mutagenesis indicated that the accumulation of cytidine pathway got strengthened.

E. coli；cytidine；aspartate transcarbamylase；site-directed mutagenesis；feedback inhibition resistance

Q784

A

1672-6510(2012)04-0012-05

2011–11–30；

2012–02–05

天津科技大學(xué)科學(xué)研究基金資助項目(20100211)

方海田（1978—），男，內(nèi)蒙古人，博士研究生；通信作者：陳 寧，教授，ningch@tust.edu.cn.

郎婧