郭小飛，陳久洲，張莉露，賈士儒，鄭 平

(1. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2. 中國科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點實驗室，天津 300308；3. 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308)

利用5-氨基乙酰丙酸脫水酶缺失的重組大腸桿菌合成5-氨基乙酰丙酸

郭小飛1,2,3，陳久洲2,3，張莉露2,3，賈士儒1，鄭 平2,3

(1. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2. 中國科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點實驗室，天津 300308；3. 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308)

生物法合成 5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)大多通過添加 5-ALA脫水酶(ALAD)的抑制劑乙酰丙酸(LA)減少 5-ALA的降解，造成生產(chǎn)成本增高，發(fā)酵工藝復(fù)雜.本文利用ALAD缺失的大腸桿菌ZSEc2作為出發(fā)菌株，通過紫外誘變的方法，獲得可利用外源血紅素恢復(fù)正常生長的大腸桿菌突變株 ZGEc1，并過表達來自沼澤紅假單胞菌的 5-ALA合成酶(ALAS)基因，最終建立一條不需要添加ALAD抑制劑的5-ALA的生物合成新路線.經(jīng)過培養(yǎng)基初步優(yōu)化，重組菌可在胞外積累約1,g/L的5-ALA.

5-氨基乙酰丙酸；5-ALA脫水酶；5-ALA合成酶；沼澤紅假單胞菌

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，5-ALA)是生物體合成血紅素、葉綠素、VB12等四吡咯化合物的必需前體，廣泛存在于動物、植物和微生物中[1-2].近年來，5-ALA不但在醫(yī)藥領(lǐng)域可以作為光動力試劑治療淺表型癌癥[3]，而且在農(nóng)業(yè)上可以用作無公害的殺蟲劑、除草劑和植物生長促進劑[4]，因而引起了人們的廣泛關(guān)注.目前，5-ALA生產(chǎn)主要依賴化學(xué)合成，成本高，收率低，也使得 5-ALA的價格高居不下(工業(yè)級5-ALA 600美元/千克，醫(yī)藥級最高達800美元/克)，并且存在嚴(yán)重的環(huán)境問題.近年來，研究者們把目光紛紛投向生物法合成5-ALA.

生物體內(nèi)5-ALA的合成途徑有兩種，分別是C4途徑和 C5途徑[5–6].目前生物法生產(chǎn) 5-ALA 大多利用重組外源 C4途徑的大腸桿菌(Escherichia coli)來實現(xiàn).C4途徑主要存在于動物、真菌和一些紫色光合細(xì)菌中，以琥珀酰輔酶 A和甘氨酸為底物，通過 5-ALA 合成酶(5-aminolevulinic acid synthase，ALAS)一步催化合成 5-ALA.生物體中 5-ALA向下代謝的第一個酶是hemB編碼的 5-ALA脫水酶(5-aminolevulinic acid dehydratase，ALAD)，催化兩分子5-ALA脫水形成一分子膽色素原(porphobilinogen，PBG)[7].目前生物法合成 5-ALA大多采用添加ALAD抑制劑乙酰丙酸(levulinic acid，LA)的策略來降低 5-ALA 的代謝[8–9]，但 LA 價格昂貴，且主要通過化學(xué)合成法制備，造成5-ALA生產(chǎn)成本增加，發(fā)酵工藝復(fù)雜.近期 Liu等[8]嘗試添加廉價的葡萄糖作為ALAD抑制劑替代 LA，但葡萄糖既是菌體生長的碳源，又是 5-ALA合成酶的抑制劑，作用機理復(fù)雜，難以精確控制.降低 5-ALA在胞內(nèi)繼續(xù)代謝的另一條策略來敲除ALAD的編碼基因hemB，但以往的知識認(rèn)為該基因是必需基因不能完全缺失，而且野生型大腸桿菌不具備攝入外源血紅素的能力，不能通過直接添加終產(chǎn)物血紅素的方式維持生長[10].但本研究室的前期工作顯示 hemB缺失的大腸桿菌 ZSEc2可以在普通LB培養(yǎng)基上生長，但是與野生菌相比生長顯著變慢[11].而 McConville等[12]的研究表明通過誘變可以使大腸桿菌獲得攝入外源血紅素的能力，這就使得利用ALAD缺失突變株生產(chǎn)5-ALA成為可能.

基于以上設(shè)想，本文探索了一種利用 ALAD缺失的重組大腸桿菌合成 5-ALA的方法.首先通過對hemB缺失的大腸桿菌 ZSEc2紫外誘變獲得了在外加血紅素的條件下能夠正常生長的大腸桿菌突變株，并以此為基礎(chǔ)過表達來自沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)ATCC 17001的ALAS基因，構(gòu)建的工程菌通過正交實驗對培養(yǎng)基進行優(yōu)化后，胞外 5-ALA積累量明顯提高，為生物法合成 5-ALA提供了一條新路線.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌 MG1655、ZSEc2(MG1655ΔhemB)和沼澤紅假單胞菌 ATCC 17001菌株以及表達載體pET21a和pTrc99A均為實驗室保存.pEasy-Blunt購自北京全式金生物技術(shù)有限公司.

1.1.2 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基：酵母提取物 5,g/L，蛋白胨 10,g/L，氯化鈉10,g/L(固體培養(yǎng)基額外加2,g/L的瓊脂粉).氨芐青霉素(Amp)終質(zhì)量濃度為100,mg/L，異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)終濃度為 0.1,mmol/L，沒有特別說明時氯化血紅素(hemin)終濃度為40,μmol/L，正交實驗優(yōu)化前發(fā)酵培養(yǎng)基中琥珀酸終質(zhì)量濃度10,g/L，甘氨酸終質(zhì)量濃度2,g/L.發(fā)酵培養(yǎng)基主成分為LB培養(yǎng)基成分.1.1.3 工具酶及試劑

DNA聚合酶，北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶、DNA 連接酶，F(xiàn)ermentas公司；質(zhì)粒小提試劑盒及DNA膠回收試劑盒，Biomiga公司；蛋白定量試劑盒(Pieree’s BCA Assay Kit)，Pierce 公司；基因組提取試劑盒，北京索萊寶科技有限公司.酵母浸出物和胰蛋白胨，英國 Oxoid公司；甘氨酸和IPTG，Promega公司；5-ALA、?；?CoA、對二甲氨基苯甲醛等，Sigma公司；氯化血紅素，上海生工生物工程有限公司；琥珀酸鈉、葡萄糖、冰醋酸、高氯酸、三氯乙酸、乙酰丙酮、氯仿以及其他常用化學(xué)試劑，國藥集團化學(xué)試劑有限公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 ZSEc2紫外誘變和突變株的篩選

紫外誘變方法參考文獻[13].出發(fā)菌株為hemB缺失的大腸桿菌 ZSEc2，一級種子液過夜培養(yǎng)，以1∶100比例轉(zhuǎn)接，收集生長對數(shù)前期菌液，生理鹽水洗 2次，并用生理鹽水制備成菌懸液(A600＝0.2).將菌懸液注入直徑為 9,cm無菌培養(yǎng)皿中，每個平皿4,mL，紫外燈功率為 8,W，將平皿固定于紫外燈下40,cm 處，紫外照射時間分別為 0、10、20、30、40、50,s，然后采用 10倍逐級稀釋的方法在 LB平板涂布，進行菌落計數(shù)，選擇致死率為 80%左右的誘變劑量進行操作.誘變菌液稀釋后，涂布血紅素濃度為40,μmol/L的 LB平板，選擇生長變快的菌落進行PCR驗證和生長比較[14].將誘變菌株分別接種添加不同濃度血紅素(10～70,μmol/L)的 LB 培養(yǎng)基中，37,℃培養(yǎng)，測定生長曲線，比較不同血紅素濃度對突變株生長的影響.

1.2.2 沼澤紅假單胞菌基因組DNA的提取

沼澤紅假單胞菌基因組的提取方法參照索萊寶試劑盒說明書.

1.2.3 沼澤紅假單胞菌 ATCC17001的,ALAS基因PCR擴增

通過已發(fā)表的同屬的ALAS基因及其上下游序列的比對，設(shè)計并合成以下通用引物，上游引物序列為5′-TC(T)AACGGGAGGACA(G/T)TCATGAA-3′，下游引物序列為 5′-CAGCAACGAGACCATCAAGCA-3′.DNA 聚合酶為北京全式金公司的 Fastpfu，PCR擴增參數(shù)為 94,℃ 2,min；94,℃ 20,s，60,℃ 20,s，72,℃1,min，循環(huán) 30次；72,℃延伸 5,min.PCR產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并用膠回收試劑盒回收后，連接載體 pEASY-Blunt，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α，涂布在含Amp的 LB固體培養(yǎng)基上，藍(lán)白斑篩選后，挑選陽性克隆接于 5,mL LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，質(zhì)粒提取驗證并測序.

1.2.4 ALAS表達載體構(gòu)建及其在大腸桿菌中表達

根據(jù)測序所得基因序列，重新設(shè)計引物擴增ALAS編碼基因，上游引物 5′-GCGCATATG AAT TACGAAGCCTATTTCCGCCGT-3′(下劃線為 NdeI酶切位點)，下游引物 5′-CTTAAGCTT TCAGTGG TGGTGGTGGTGGTGGGCCGCCTTGGCGAGACC GAC-3′(下劃線為 HindⅢ酶切位點).PCR 擴增參數(shù)為 95,℃ 2,min；95,℃ 20,s，65,℃ 20,s，72,℃ 1,min，循環(huán) 30次；72,℃延伸 5,min.PCR產(chǎn)物回收后用 NdeI和HindⅢ雙酶切并純化，以適當(dāng)比例與NdeI和HindⅢ雙酶切的pET21a載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有Amp的LB平板，挑取陽性克隆提取質(zhì)粒并進行 PCR和酶切驗證.測序正確的重組載體命名為 pET21a-ALAS.用 XbaI和 HindⅢ對 pET21a-ALAS雙酶切，純化回收 ALAS基因片段，以適當(dāng)比例與XbaI和HindⅢ雙酶切的pTrc99A載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α，涂布含有Amp的固體LB平板，驗證正確載體命名為 pTrc99A-ALAS并分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌MG1655、ZSEc2和誘變所得菌株.

1.2.5 蛋白電泳及酶活測定

重組菌株挑單菌落過夜培養(yǎng)，再按初始接種量為A600＝0.05轉(zhuǎn)接新鮮的LB培養(yǎng)基，當(dāng)吸光度約為0.5時，加入終濃度為 0.1,mmol/L的 IPTG，28,℃誘導(dǎo)過夜，離心收集菌體.菌體用50,mmol/L pH 7.0磷酸鉀緩沖液沖洗 2次，懸浮超聲破碎，冷凍離心后取上清液用于 SDS-PAGE和酶活分析.蛋白定量方案參見 BCA蛋白定量試劑盒說明書.酶活分析參考文獻[6]，酶反應(yīng)液包括 50,mmol/L Tris-HCl、20,mmol/L MgCl2、0.1,mol/L琥珀酸鈉、0.1,mol/L甘氨酸、0.1,mmol/L磷酸吡哆醛、15,mmol/L ATP、0.2,mmol/L輔酶 A，pH 為 7.5，加入一定量的粗酶液，37,℃反應(yīng)10,min，加入 1/2體積 10%的三氯乙酸終止反應(yīng)，離心取上清液進行5-ALA定量，1個酶活力單位(U)定義為每分鐘產(chǎn)生1,nmol/L 5-ALA所需要的酶量.

5-ALA 含量分析按照文獻[15].200,μL 樣液加入100,μL pH 4.6乙酸緩沖液，加入5,μL乙酰丙酮，100,℃水浴 15,min，冷卻至室溫加等體積的 Ehrlish’s試劑(42,mL冰醋酸，8,mL 70%高氯酸，1,g二甲氨基苯甲醛)，顯色 10,min后測 553,nm 波長下的吸光度.

1.2.6 血紅素濃度對突變株胞外5-ALA含量的影響

含有 pTrc99A-ALAS的突變株挑單克隆過夜培養(yǎng)，再按初始接種量為A600＝0.05轉(zhuǎn)接含琥珀酸和甘氨酸以及不同濃度血紅素(10～60,μmol/L)的 LB 培養(yǎng)基中，37,℃培養(yǎng)至菌體生長前對數(shù)期添加 IPTG，28,℃誘導(dǎo) 16,h，測定發(fā)酵液中 5-ALA 的含量，比較不同血紅素濃度對5-ALA產(chǎn)量的影響.

1.2.7 發(fā)酵培養(yǎng)基成分優(yōu)化

為了改善重組菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長狀況，進一步提高胞外 5-ALA的積累量，確定底物以及碳源的最適添加濃度，本研究參考近幾年生物發(fā)酵合成5-ALA的文獻[16-19]，確定了對菌體生長和 5-ALA合成影響較大的3個因素：甘氨酸、琥珀酸、葡萄糖，并設(shè)計正交實驗對各因素進行評價.在 LB培養(yǎng)基中，添加琥珀酸、甘氨酸以及葡萄糖.以甘氨酸、琥珀酸和葡萄糖質(zhì)量濃度為考察因素，選取 3個水平，做 3因素3水平正交實驗.

2 結(jié)果與分析

2.1 突變株的驗證及培養(yǎng)條件確定

實驗室前期獲得的hemB結(jié)構(gòu)基因缺失的ZSEc2菌株，在 LB培養(yǎng)基中可以生長，但與野生型相比非常弱，不能直接用于合成 5-ALA，因此首先對該菌株進行優(yōu)化改造，使其獲得攝入外源血紅素的能力，能夠利用外源血紅素恢復(fù)生長.首先對ZSEc2菌株進行紫外誘變，將紫外照射的菌體涂布含氯化血紅素的LB平板，大腸桿菌K12菌株不能利用外源血紅素，在篩選平板上不能恢復(fù)正常生長，而獲得攝入外源血紅素能力的突變株可以恢復(fù)生長.在平板上挑取 4個生長明顯加快的單克隆，分別編號為ZGEc1～ZGEc4進行菌落 PCR驗證，結(jié)果如圖 1所示.核酸凝膠電泳結(jié)果顯示獲得的 4株突變菌株ZGEc1～ZGEc4的目的片段大小為 600,bp，與hemB缺失菌株ZSEc2結(jié)果一致，而含有完整hemB基因的MG1655片段大小為1,410,bp，說明 4個生長變快的誘變菌株仍然為hemB基因缺失突變株.

對 ZGEc1～ZGEc4進行生長比較，發(fā)現(xiàn) 4個菌株都基本恢復(fù)正常生長，本研究選取生長最好的ZGEc1作為后續(xù)實驗的出發(fā)菌株.對誘變獲得的突變株 ZGEc1以及對照菌株 MG1655和 ZSEc2進行生長狀態(tài)的比較，結(jié)果如圖 2所示.與出發(fā)菌株ZSEc2相比，ZGEc1在含有血紅素的LB培養(yǎng)基中生長明顯加快，而圖 3顯示外源血紅素濃度在20,μmol/L以上即可使菌體生長恢復(fù)，以上結(jié)果說明誘變使得 ZGEc1獲得攝入外源血紅素的能力，在外源血紅素存在的條件下生長良好，可以用于后續(xù)5-ALA工程菌的構(gòu)建.

圖1 菌落PCR驗證核酸電泳圖Fig. 1 Electrophoresis of colony PCR confirmation

圖2 MG1655、ZGEc1和ZSEc2在LB與LB添加血紅素培養(yǎng)基中生長比較Fig. 2 Growth comparison of MG1655，ZGEc1 and ZSEc2 incubated in LB or LB with hemin

圖3 血紅素濃度對ZGEc1生長的影響Fig. 3 Effect of hemin concentration on the growth of ZGEc1

2.2 沼澤紅假單胞菌ALAS基因的克隆及表達

通過 NCBI數(shù)據(jù)庫搜索，設(shè)計簡并引物，以沼澤紅假單胞菌ATCC 17001基因組DNA為模板，PCR擴增得到與預(yù)期大小相近的片段(圖 4).測序發(fā)現(xiàn)ATCC 17001的,ALAS基因的核酸序列(GenBank登陸號：JQ048720)與沼澤紅假單胞菌 BisB5,hemA基因的核酸序列相似性為 99%，氨基酸序列完全一致.將獲得片段插入表達載體 pTrc99A，構(gòu)建了帶有沼澤紅假單胞菌ATCC 17001的ALAS基因的重組載體pTrc99A-ALAS.

圖4 沼澤紅假單胞菌ALAS基因片段PCR擴增電泳圖Fig. 4 Electrophoresis of the amplified ALAS encoding gene product

重組載體pTrc99A-ALAS轉(zhuǎn)化大腸桿菌MG1655和ZGEc1.驗證正確后誘導(dǎo)表達，結(jié)果如圖5所示.

圖5 ALAS在MG1655及ZGEc1中表達的SDS-PAGE圖譜Fig. 5 SDS-PAGE of ALAS expressed in MG1655 and ZGEc1

從SDS-PAGE結(jié)果(圖 5)可以看出ALAS在ZGEc1和MG1655中都能表達，且表達強度基本一致，粗酶液中ALAS的酶活分別為14.6、13,U/mg，表明hemB缺失及后續(xù)的紫外誘變對外源 ALAS的表達和活性沒有太大影響.

2.3 外源血紅素濃度對胞外5-ALA積累的影響

由于 ALAS受代謝終產(chǎn)物血紅素的反饋調(diào)控，因此首先檢測 ZGEc1/pTrc99A-ALAS在含有不同濃度血紅素的發(fā)酵培養(yǎng)基中胞外 5-ALA的積累量，結(jié)果如圖 6所示.在血紅素濃度低于 40,μmol/L時，隨著血紅素濃度增加，發(fā)酵液中 5-ALA的產(chǎn)量不斷增加，當(dāng)血紅素濃度為40,μmol/L時，胞外5-ALA的積累量達到最大值，之后隨著血紅素濃度的提高，胞外5-ALA的積累量逐漸減少，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是高濃度的血紅素對 ALAS的活性產(chǎn)生了抑制作用，為了避免外源血紅素對5-ALA積累的不利影響，將胞外血紅素的添加量確定為 40,μmol/L.同時，結(jié)果顯示在添加底物和誘導(dǎo)劑 IPTG的培養(yǎng)基中，重組菌的生長明顯受限，最終在 600,nm的吸光度只有2.2，遠(yuǎn)低于在普通 LB培養(yǎng)基中的最終吸光度，受菌體量的影響，胞外5-ALA的積累量也只有0.313,g/L.

圖6 血紅素濃度對重組菌胞外5-ALA積累的影響Fig. 6 Effect of hemin on cell growth and 5-ALA accumulation of the recombined strain ZGEc1/pTrc99AALAS

2.4 培養(yǎng)基的正交實驗優(yōu)化

從正交實驗結(jié)果表1的數(shù)據(jù)分析，可以首先確定實驗因素的優(yōu)水平和最優(yōu)水平組合，優(yōu)水平分別為甘氨酸 4,g/L、琥珀酸 10,g/L、葡萄糖 5,g/L，3個因素的優(yōu)水平組合也是本實驗的最優(yōu)組合.對實驗因素進行極差R分析發(fā)現(xiàn)，3因素對實驗指標(biāo)影響的主次順序是葡萄糖＞琥珀酸＞甘氨酸.通過 SPSS軟件處理，得到方差分析和顯著性檢驗結(jié)果見表 2.當(dāng)置信度為 95%(P＝0.05)時，因素臨界值為 F0.05(2，8)＝4.46，F(xiàn)葡萄糖＞F0.05(2，8)，說明葡萄糖為置信度 95%的顯著性影響因素.

最優(yōu)培養(yǎng)基條件下胞外 5-ALA產(chǎn)量達到0.987,g/L，是未優(yōu)化的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)量0.313,g/L的 3.3倍，發(fā)酵液最終在 600,nm 的吸光度也達到5.5，是未優(yōu)化之前的2.5倍，菌體生長和胞外5-ALA的產(chǎn)量均達到較高的水平.

表1 正交實驗設(shè)計及結(jié)果極差分析Tab. 1 Design and results of orthogonal experiment

表2 正交實驗方差分析Tab. 2 Variance analysis of orthogonal experiment

3 結(jié) 語

本研究以 ALAD缺失突變株為出發(fā)菌株完全阻斷5-ALA的代謝途徑，避免了添加昂貴的ALAD抑制劑；通過誘變獲得能夠攝入外源血紅素的突變株，依靠添加少量血紅素即可部分恢復(fù) ALAD缺失菌株的生長，結(jié)合外源 ALAS的表達，保證了 5-ALA的積累，建立了一條新的構(gòu)建 5-ALA工程菌的途徑.利用更廉價的、來源更為廣泛的動物血制品作為血紅素替代品的研究有望進一步降低生產(chǎn)成本，為5-ALA的工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).

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Production of 5-aminolevulinic Acid with 5-aminolevulinic Acid Dehydratase DeficientEscherichia coliMutant

GUO Xiaofei1,2,3，CHEN Jiuzhou2,3，ZHANG Lilu2,3，JIA Shiru1，ZHENG Ping2,3
(1. College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China；2. Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308，China；3. Tianjin Institutes of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308，China)

5-aminolevulinic acid(5-ALA) is most often biosynthesized by adding 5-ALA dehydratase(ALAD)inhibitorlevulinic acid(LA)to reduce 5-ALA degradation，which leads to the increase of cost and makes the fermentation technology complicated. In this study，we used a 5-ALA dehydratase deficientE. colimutant ZSEc2,as the starting strain. By applying UV mutagenesis，the mutant ZGEc1,was bred and the strain could retrieve normal growth via consumption of extracellular hemin. Then the 5-ALA synthase fromRhodopseudomonas palustriswas over-expressed in the mutant ZGEc1,and a new biosysthesis process of 5-ALA was developed without adding 5-ALA dehydratase inhibiton. After medium optimization，the resultant recombined strain produced about 1,g/L 5-ALA.

5-aminolevulinic acid；5-ALA dehydratase；5-ALA synthase；Rhodopseudomonas palustris

Q815

A

1672-6510(2012)04-0001-06

2012-02-14；

2012-04-16

國家自然科學(xué)基金資助項目(31070037)；中國科學(xué)院知識創(chuàng)新工程項目(KSCX2-EW-Q-13)

郭小飛（1986—），女，山西大同人，碩士研究生；通信作者：鄭 平，副研究員，zheng_p@tib.cas.cn.

郎婧