莫正英 王鳳琴 梁清樂

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我國南方地區(qū)常見的1種惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率均居世界首位，嚴重威脅我國人民的身體健康和生命。盡管人們一直在探索鼻咽癌的發(fā)病機制，但鼻咽癌的發(fā)病機制還不清楚。大量的研究表明[1～3]，腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多基因參與、多階段的病理過程，其中癌基因的激活和抑癌基因的失活是腫瘤發(fā)生與發(fā)展的重要原因，而啟動子區(qū)DNA甲基化又是抑癌基因失活的重要機制之一。抑癌基因失活的主要方式有基因的缺失、突變和啟動子區(qū)域的過甲基化等[4]，尤其是抑癌基因啟動子區(qū)CpG島過甲基化是腫瘤發(fā)生的重要環(huán)節(jié)之一。DNA甲基化(DNA methylation)修飾是基因表達調控的重要表觀遺傳學機制之一，它通過延遲DNA復制、抑制轉錄起始、改變染色質的物理或化學結構使基因轉錄沉默(silencing)，導致基因功能失活[5]。5-雜氮-2′-脫氧胞苷(5-aza-2dC)是1種DNA甲基轉移酶1(DNMT 1)的抑制劑，很多體外研究證實，5-aza-2dC通過去甲基化作用使多種CpG島過甲基化的抑癌基因重新表達，而恢復抑癌功能[6，7]。但5-aza-2dC對人低分化鼻咽鱗癌細胞株CNE2的作用少見報道。為探討DNA 甲基轉移酶抑制劑5-aza-2dC對人低分化鼻咽鱗癌細胞株CNE2的影響，本研究以CNE2細胞株為樣本，用不同濃度5-aza-2dC處理CNE2細胞，使它的甲基化沉默基因重新表達，檢測其對CNE2的影響，為臨床治療提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

人低分化鼻咽癌細胞株CNE2購于武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心。奈達鉑(nedaplatin,NDP)(江蘇奧賽康藥業(yè)有限公司產品)；5-aza-2dC(美國Sigma公司)，RPMI 1640培養(yǎng)液(美國GIBCO公司)，小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，MTT(Amresco公司)，二甲亞砜(DMSO,SIGMA公 司)，酶聯免疫檢測儀(BIO-RAD550，美國伯樂公司)，流式細胞儀(美國Beckman公司)。

1.2 方法

1.2.1 試劑配制 5-aza-2dC用含10% 小牛血清的RPMI 培養(yǎng)液溶解，配成濃度為10-3mol/L的儲存液，-20℃保存，使用時用RPMI 培養(yǎng)液稀釋為工作液。MTT溶于PBS中，過濾除菌，濃度為5 mg/ml，避光冷藏。

1.2.2 細胞培養(yǎng) CNE2細胞在RPMI 1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)(10%小牛血清)，于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數生長期細胞用0.25%胰酶消化，用4 g/L苔盼藍染色后計算細胞存活率，細胞存活率達99%時進行細胞計數，調整細胞懸液濃度至1×105/ml備用。

1.2.3 5-aza-2dC處理鼻咽癌細胞 CNE2細胞以104/ml密度接種到96孔培養(yǎng)板中，細胞貼壁后換含5-aza-2dC新鮮培養(yǎng)液，每24 h更換含有5-aza-2dC的培養(yǎng)液，對照組CNE2細胞用不含5-aza-2dC的培養(yǎng)液同時培養(yǎng)。

1.3 MTT比色法檢測5-aza-2dC對鼻咽癌細胞生長的影響

96孔板接種細胞，每孔104個，每孔均加入200 μl含10% 小牛血清RPMI 1640完全培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h細胞完全貼壁后吸出每個孔的培養(yǎng)液，分別加入10-7、10-6、10-5、10-4mol/L濃度的5-aza-2dC處理，以不加藥物為陰性對照組，以奈達鉑(1 μg/ml)處理為陽性對照組，每孔中體積為200 μl。每組3個重復。培養(yǎng)0、12、24、36、48、72 h，按照培養(yǎng)的不同時間點收集細胞。實驗終止前4 h加入MTT液20 μl/孔，實驗結束后吸取培養(yǎng)液，每空加入150 μl DMSO,平板震蕩10 min，應用酶聯免疫檢測儀，于490 nm波長處測定各孔吸光度OD值，然后繪制細胞生長曲線。

1.4 流式細胞術檢測5-aza-2dC對鼻咽癌細胞凋亡的影響

CNE2細胞處理同1.2.3，5-aza-2dC處理 72 h后，收集細胞，制成單細胞懸液，2 000 r/min離心5 min，棄去上清，PBS洗3次；70%預冷的乙醇、4℃固定2 h，調整細胞濃度為106個/ml，應用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.5 甲基化特異性PCR檢測DAPK 啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)

DARK基因甲基化引物。甲基化引物，上游 5′-GGATAGTCGGATCGAGTTAACGTC-3′；下游 5′-CCCT-CCCAAACGCCGA-3'； 片段長度98 bp。非甲基化引物，上游 5′-GGAGGATAGTTGGATTGAGTTAATGTT-3′；下游 5′-CAAATCCCTCCCAAACACCAA-3′；片段長度108 bp。 以β-actin為內參，逆轉錄后行目的基因和β-actin cDNA擴增。分別取逆轉錄產物2.5 μl用于PCR檢測。 50 μl 體系包括：10×PCR buffer 5 μl ，2.5 mmol/L dNTP mix 4 μl ，上、下游引物各20 pmol，Taq DNA polymerase 0.4 μl ，模板cDNA 2.5 μl,滅菌水36.1 μl。VEGF PCR 條件：94℃預變性3 min,94℃ 30 s,58℃ 30 s,72℃ 1 min,30次循環(huán)，72℃延伸10 min。取PCR 產物置于2%瓊脂糖凝膠中電泳，溴化乙錠染色，電泳條帶經電泳圖像分析儀照相。

1.6 統(tǒng)計學處理

所有資料均應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料的比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MTT檢測細胞增殖

不同濃度5-aza-2dC處理CNE2細胞0、6、12、24、48、72 h后，MTT比色法檢測細胞增殖，結果顯示隨著抑制劑濃度的增加和處理時間的延長，其抑制CNE2細胞增殖作用增強，統(tǒng)計結果顯示同一作用時間下不同藥物濃度組間，細胞生存率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),10-4mol/L 5-aza-2dC處理CNE2細胞72 h，對細胞增殖抑制作用最明顯(P<0.05)，見圖1。

圖1 不同濃度5-aza-2dC處理CNE2細胞的增殖曲線

2.2 流式細胞術檢測5-aza-2dC對鼻咽癌細胞凋亡的影響

不同濃度5-aza-2dC處理CNE2細胞72 h后，應用流式細胞儀檢測細胞凋亡，發(fā)現10-4mol/L 5-aza-2dC誘導細胞凋亡最明顯(P<0.01)(表1)。結合MTT結果，發(fā)現10-4mol/L 5-aza-2dC處理CNE2細胞72 h細胞凋亡最明顯。

表1 不同濃度5-aza-2dC對鼻咽癌細胞凋亡的影響

注 *為與對照組比較,P<0.01

2.3 5-aza-2dC對CNE2細胞DAPK啟動子甲基化狀態(tài)的影響

MSP法檢測CNE2細胞DAPK啟動子甲基化狀態(tài)的結果顯示：甲基化引物的擴增條帶為陽性，非甲基化引物擴增條帶為陰性。5-aza-2dC作用后，CNE2細胞甲基化引物擴增條帶為陰性，非甲基化引物擴增條帶為陽性，見圖2。

圖2 5-aza-2dC處理前后CNE2細胞DAPK啟動子甲基化狀態(tài)

3 討論

鼻咽癌是1種極具特色的腫瘤，有著奇特的分布和復雜的病因學。在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中，癌基因激活或過度表達并不是一個主要因素。在鼻咽癌中，經典的癌基因如ras基因及mdm2基因的突變在鼻咽癌中并不多見，相反，在鼻咽癌的演進過程中，腫瘤抑制基因的失活卻更為普遍，且發(fā)揮更重要的作用。研究發(fā)現鼻咽癌中存在多個腫瘤抑制基因的失活。而近年來研究發(fā)現，許多腫瘤抑制基因在鼻咽癌中因甲基化而失活，相對于突變及基因缺失，鼻咽癌中腫瘤抑制基因的表觀遺傳學改變?yōu)楦毡閇8]。啟動子區(qū)CpG 島高甲基化是腫瘤抑制基因失活的基本機制[9]。在鼻咽癌中腫瘤相關基因的甲基化改變參與了包括細胞周期調控、DNA 修復、細胞凋亡及腫瘤浸潤轉移的全過程。DNA過甲基化是引起抑癌基因失活的重要方式，DNA過甲基化并不是基因序列發(fā)生改變，而只是部分堿基對發(fā)生甲基化修飾，這種異常的甲基化模式是可以逆轉的[10]。5-aza-2dC是DNMT1的抑制劑，在DNA復制過程中與DNA分子相結合，并與DNMT1形成一共價復合物，抑制該酶的甲基轉移活性，生成低甲基化子鏈，從而實現去甲基化功能，恢復多個抑癌基因的表達。5-aza-2dC可使多種因甲基化而失活的抑癌基因重新表達，并且可以誘導凋亡，體外實驗證明其可抑制多種腫瘤細胞的生長[11，12]。 本研究顯示人低分化鼻咽癌細胞株CNE2經過5-aza-2dC處理后，細胞狀態(tài)發(fā)生明顯改變，經MTT法檢測的細胞生長曲線可以看出細胞增殖受到不同程度的抑制。說明5-aza-2dC可以抑制人低分化鼻咽癌細胞株CNE2的增殖，誘導腫瘤細胞的凋亡，并且抑制作用呈濃度依賴性，隨著濃度增大其抑制作用也越強。在48～72 h內，同一濃度5-aza-2dC隨著作用時間的延長，其抑制作用也增強，在10-4mol/L作用72 h時抑制作用最強。流式細胞儀檢測也顯示出細胞凋亡與5-aza-2dC的作用濃度呈依賴性，在10-4mol/L濃度下作用72 h后，細胞凋亡數最多，流式細胞儀檢測結果和MTT檢測結果都說明5-aza-2dC在10-4mol/L濃度下，處理人低分化鼻咽癌細胞株CNE2能產生明顯的生物學效應，能抑制腫瘤細胞增殖。

MSP技術分別檢測5-aza-2dC處理前后DAPK啟動子的甲基化狀態(tài)，發(fā)現處理前CNE2細胞中DAPK啟動子區(qū)為高甲基化狀態(tài)，而處理后的CNE2細胞中DAPK啟動子區(qū)恢復非甲基化狀態(tài)，其機制可能是使因甲基化而失活的抑癌基因重新激活而誘導腫瘤細胞的凋亡。本結果說明，5-aza-2dC在體外可能是通過將人低分化鼻咽癌細胞株CNE2中因甲基化而失活的某些抑癌基因去甲基化而重新表達，從而恢復其抑制腫瘤生長的功能，并且誘導腫瘤細胞凋亡，進而抑制了人低分化鼻咽癌細胞株CNE2的生長。

綜上，5-aza-2dC在體外可以抑制人低分化鼻咽癌細胞株CNE2增殖，其作為1種甲基化轉移酶抑制劑，可以激活人低分化鼻咽癌細胞株CNE2中因甲基化而失活的某些抑癌基因，從而恢復抑制腫瘤生長的功能，引起細胞凋亡，為臨床治療用藥提供了一個新的思路，為以后5-aza-2dC在鼻咽癌中的研究提供科學依據。

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