楊金霞，姚婷玉，王健偉，張丹

(蘇州高新技術(shù)創(chuàng)業(yè)服務(wù)中心生物醫(yī)藥分析測(cè)試中心，江蘇蘇州 215011)

核磁共振法測(cè)定西洛他唑含量

楊金霞，姚婷玉，王健偉，張丹

(蘇州高新技術(shù)創(chuàng)業(yè)服務(wù)中心生物醫(yī)藥分析測(cè)試中心，江蘇蘇州 215011)

建立核磁共振（1H NMR）法測(cè)定西洛他唑含量的方法。采用Bruker Avance Ⅲ400 MHz核磁共振波譜儀，以1，2，4，5-四氯-3-硝基苯為內(nèi)標(biāo)，氘代氯仿為溶劑，zg30脈沖序列。對(duì)實(shí)驗(yàn)參數(shù)如掃描次數(shù)、延遲時(shí)間等進(jìn)行優(yōu)化。西洛他唑質(zhì)量在5～30 mg范圍內(nèi)，樣品和內(nèi)標(biāo)物的積分面積比值與樣品和內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量比值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)r=0.995 3，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于0.4%（n=5)。該方法可用于藥品的質(zhì)量控制和監(jiān)管。

核磁共振法；西洛他唑；含量

西洛他唑（cilostazol）臨床上主要用于改善慢性動(dòng)脈閉塞癥引起的缺血性癥狀，如潰瘍、肢痛、發(fā)冷及間歇性跛行［1］。經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)及國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)［2，3］，目前測(cè)定西洛他唑的方法有高效液相色譜法（HPLC），該法以甲醇-水為流動(dòng)相，定量檢測(cè)需要對(duì)照品，且檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)。中國(guó)藥典2010年二部附錄Ⅸ［4］首次引入核磁共振波譜法，但沒(méi)有具體品種藥物的NMR定量方法。隨著現(xiàn)代儀器靈敏度的不斷提高，NMR定量法測(cè)定藥物含量將成為今后發(fā)展的趨勢(shì)［5，6］。

筆者采用1H NMR法測(cè)定西洛他唑含量，通過(guò)對(duì)西洛他唑結(jié)構(gòu)(圖1)分析，選擇西洛他唑結(jié)構(gòu)中5，7，8三個(gè)氫的吸收為特征峰，用已知純度的標(biāo)準(zhǔn)品1，2，4，5-四氯-3-硝基苯中1個(gè)氫為定量?jī)?nèi)標(biāo)，根據(jù)核磁信號(hào)強(qiáng)度與質(zhì)子數(shù)目成正比的特點(diǎn)對(duì)藥物進(jìn)行定量分析［4］。該法簡(jiǎn)便、專(zhuān)屬性較強(qiáng)，不需要西洛他唑?qū)φ掌?，?duì)樣品無(wú)破壞，準(zhǔn)確性、重復(fù)性較好。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

核磁共振波譜儀：Bruker Avance Ⅲ400 MHz型，瑞士Bruker公司；

圖1 西洛他唑化學(xué)結(jié)構(gòu)式

BBO探頭：5 mm；

核磁管：內(nèi)徑5 mm；

電子天平：XS205，d=0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司；

溶劑：CDCl3，氘代度 99.8%+0.03%TMS，美國(guó)CIL公司；

定量?jī)?nèi)標(biāo)：1，2，4，5-四氯-3-硝基苯，批號(hào)421-7A，純度99.3%，美國(guó)Chem Service 公司；

西洛他唑原料：蘇州中化藥品工業(yè)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

采用zg30脈沖序列［7］；測(cè)定溫度（探頭溫度）：300 K；溶劑：CDCl3；采樣次數(shù)（NS）：8，TD=65 536；譜寬：8 012.82 Hz；脈沖寬度（P1）：10.60 μs；脈沖功率（PL1）：-2.00 dB；脈沖延遲時(shí)間（d1）：15 s；采樣時(shí)間（AQ）：4.0 894 966 s。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

精密稱(chēng)取西洛他唑30 mg和1，2，4，5-四氯-3-硝基苯10 mg置于直徑5 mm的核磁管中，加入1.0 mL CDCl3使其完全溶解，蓋上管帽，按1.2實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行氫譜檢測(cè)，調(diào)節(jié)儀器參數(shù)，勻場(chǎng)，采樣，圖譜處理，確定結(jié)構(gòu)無(wú)誤后，選擇西洛他唑的特征峰（7.6≤δ≤ 7.8）和 1，2，4，5-四氯-3-硝基苯的單峰（6.6≤δ≤6.8）作為定量分析的特征峰，將其積分，取5次測(cè)定結(jié)果的平均值，按1.4中公式計(jì)算西洛他唑的含量。

1.4 結(jié)果計(jì)算

西洛他唑含量按下式計(jì)算：

式中：CS——待測(cè)樣品的含量；

mR——內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量，mg；

AS，AR——樣品和內(nèi)標(biāo)物的定量特征峰積分面積；

ES，ER——樣品和內(nèi)標(biāo)物的定量特征峰質(zhì)子當(dāng)量質(zhì)量（以分子量除以定量特征峰對(duì)應(yīng)的質(zhì)子數(shù)），Da；

CR——內(nèi)標(biāo)物的含量；

ms——樣品質(zhì)量，mg。

2 結(jié)果與討論

2.1 溶劑的選擇

當(dāng)選擇CDCl3為溶劑時(shí)，樣品和內(nèi)標(biāo)物能夠完全溶解，且溶劑峰（δ=7.72）與樣品的定量特征峰（δ=6.70）完全分離，不相互干擾，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，因此選擇CDCl3為溶劑。

2.2 內(nèi)標(biāo)物的選擇

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，1，2，4，5-四氯-3-硝基苯只有一個(gè)特征參考峰（δ=7.74）與樣品西洛他唑的特征峰（δ=6.70）完全分離，而且這兩組峰與其它峰也能完全分開(kāi)，峰兩側(cè)的基線平坦，其積分值比較準(zhǔn)確，可作為定量分析的依據(jù)。因此選擇1，2，4，5-四氯-3-硝基苯為定量?jī)?nèi)標(biāo)物。

2.3 樣品量的選擇

配制不同濃度的樣品進(jìn)行分析，試驗(yàn)結(jié)果顯示，樣品最低濃度為0.01 mol／L即可滿(mǎn)足檢測(cè)要求。

2.4 延遲時(shí)間d1的選擇

當(dāng)d1≥5×T1（T1為縱向弛豫時(shí)間）才能保證在下次掃描時(shí)磁化矢量完全回到Z軸，否則對(duì)結(jié)果的影響較大。分別設(shè)置 d1=1，2，4，6，8，10，15，20，25 s ，進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，d1≤15 s時(shí)，隨著d1的增加，樣品和內(nèi)標(biāo)的峰面積比值逐漸增大；d1＞15 s時(shí)，樣品和內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值沒(méi)有明顯變化，因此d1選擇15 s。

2.5 掃描次數(shù)NS的選擇

將掃描次數(shù) NS 設(shè)定為 4，8，16，32，64，128，對(duì)樣品分別進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，掃描次數(shù)改變，樣品和內(nèi)標(biāo)物積分面積的比值沒(méi)有明顯變化，因此選擇NS=8。

2.6 工作曲線

精密稱(chēng)取內(nèi)標(biāo)物24.8 mg ，置于5 mL容量瓶中，加適量CDCl3充分振搖使其完全溶解，用溶劑CDCl3定容至刻度，作為內(nèi)標(biāo)溶液；精密稱(chēng)取西洛他唑 5.4，10.4，15.2，20.1，25.3，30.0 mg 分別加入到核磁管中，各加入內(nèi)標(biāo)溶液1.0 mL，使其完全溶解后，按1.2實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行氫譜檢測(cè)，對(duì)樣品和內(nèi)標(biāo)物的特征峰分別積分，每個(gè)濃度樣品的積分面積取3次測(cè)定結(jié)果的平均值，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 樣品與內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量及其特征峰面積

利用樣品和內(nèi)標(biāo)物積分面積的比值（y）對(duì)樣品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量的比值（x）進(jìn)行線性回歸，回歸方程為y=2.406 1x-0.523 6，相關(guān)系數(shù)r=0.995 9，線性范圍為 5.0～30.0 mg。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

按1.2實(shí)驗(yàn)條件對(duì)批號(hào)為X21-002，X21-003樣品溶液（編號(hào)為1#，2#）進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定5次，計(jì)算樣品和內(nèi)標(biāo)物的特征峰面積的比值，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.12%，0.31%，由此可見(jiàn)方法的重復(fù)性較好。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將批號(hào)為X21-003的樣品溶液在室溫下分別放置 0，2，4，6，8，10，12，24 h 后進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算樣品和內(nèi)標(biāo)物特征峰面積的比值，8次測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.36%，表明樣品在24 h內(nèi)放置穩(wěn)定。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品測(cè)定

取3批西洛他唑樣品分別用本法和標(biāo)準(zhǔn)方法（HPLC法）進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，核磁共振法與標(biāo)準(zhǔn)方法的測(cè)定結(jié)果相符合。以1#樣品為例，樣品、內(nèi)標(biāo)物及溶劑的1H NMR譜圖見(jiàn)圖2。

表4 樣品測(cè)定結(jié)果

圖2 樣品、內(nèi)標(biāo)物及溶劑的1H NMR譜圖

2.10 其它影響因素

（1）為保證NMR定量結(jié)果的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性，圖譜的處理很關(guān)鍵：首先要保證勻場(chǎng)要好，否則會(huì)造成半峰寬的加寬和峰型的變化，影響積分面積。勻場(chǎng)好壞的判斷標(biāo)準(zhǔn)為：氘代試劑中的內(nèi)標(biāo)物TMS除了出現(xiàn)尖銳的單峰外，在其峰的底部?jī)蓚?cè)各有一個(gè)小峰。相位調(diào)整要仔細(xì)，應(yīng)將譜圖放大后調(diào)整峰形左、右輪廓線與水平的基線剛好重合，積分面積的起、止點(diǎn)每次要一致，基線要平直，并對(duì)該組峰面積的積分取5次測(cè)定結(jié)果的平均值，以減少誤差。

（2）為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性可以再選擇樣品的另一組信號(hào)峰以同樣的方法進(jìn)行定量，然后以這兩組峰測(cè)量結(jié)果的平均值作為含量測(cè)定的結(jié)果,這樣更接近藥品含量的真實(shí)結(jié)果。

3 結(jié)語(yǔ)

采用NMR法測(cè)定西洛他唑藥品含量，測(cè)定結(jié)果的重復(fù)性及穩(wěn)定性均較好，該方法具有快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單的特點(diǎn)。在被測(cè)樣品沒(méi)有高純度對(duì)照品或難以得到對(duì)照品的情況下，可以作為藥品含量測(cè)定的補(bǔ)充，在含量檢測(cè)的同時(shí)，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證（即藥物鑒定），這對(duì)防止假冒、偽劣藥品的出現(xiàn)具有極其重要的意義。

［1］Kambayashi J，Liu Y G，Sun B，et al. Ciloslazol as a unique antithrombotic agent ［J］. Curr Pharm Des 2003，9(28)：2 281-2 291.

［2］王存芳，嚴(yán)啟新，李勇.HPLC法測(cè)定西洛他唑含量［J］.中華醫(yī)學(xué)研究雜志，2006(1)： 21-22.

［3］YBH 05382004 西洛他唑［S］.

［4］國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典［M］.二部：附錄.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.

［5］孫靜霞，張正行.NMR在藥物定量分析中的應(yīng)用［J］.藥物分析雜志，2005，25(1)： 117-122.

［6］于小波，沈文斌，相秉仁.定量核磁共振技術(shù)及其在藥學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展［J］.藥學(xué)進(jìn)展，2010，34(1)： 17-24.

［7］張友杰，劉小鵬.藥物核磁共振定量分析參數(shù)研究［J］.波譜學(xué)雜志，2007，24(3)： 289-295.

Determination of Cilostazol by1H NMR

Yang Jinxia, Yao Tingyu, Wang Jianwei, Zhang Dan
（Analytical and Testing Center of Bio-Medicine in Suzhou New & High-Tech Innovation Service Center，Suzhou 215011， China ）

A method for the determination of cilostazol by1H NMR was established. Proton nuclearmagnetic resonance spectroscopy(1H NMR) spectra were obtained in CDCl3with the internal standard 1，2，4，5-tetr-achloro-3-nitrobenzene and zg30 pulse sequence by using Bruker AvanceⅢ400 MHz spectrometer. Testing parameters such as scanning number，delay time were optimized. Area ratio of sample and internal standard was linear with mass ratio of sample and internal standard in the range of 5.0-30 mg for cilostazol concentration,r=0.995 3. The relative standard deviation of detection results was less than 0.4%(n=5). This method is suitable for quality control and supervision.

NMR; cilostazol; content

O 657.2

A

1008-6145(2012)04-0068-03

10.3969／j.issn.1008-6145.2012.04.021

聯(lián)系人：楊金霞；E-mail： yjx@csibi.cn

2012-04-17