王群，丁軼聰

（阜陽(yáng)市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，安徽阜陽(yáng) 236000）

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定酒類中甜蜜素含量的探討和改進(jìn)

王群，丁軼聰

（阜陽(yáng)市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，安徽阜陽(yáng) 236000）

對(duì)SN／T1948-2007 《進(jìn)出口食品中環(huán)基氨基磺酸鈉的檢測(cè)方法 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜》中關(guān)于酒類中環(huán)己基氨基磺酸鈉含量測(cè)定方法存在的問(wèn)題進(jìn)行探討和改進(jìn)。使用氮吹儀去除樣品中含有的乙醇，通過(guò)C18色譜柱進(jìn)行分離，以0.1%甲酸水溶液-甲醇作為流動(dòng)相，在ESI負(fù)離子模式下檢測(cè)。環(huán)己基氨基磺酸納含量在10～100 ng／mL的范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=0.999 6，檢出限為0.01 mg／kg。在兩個(gè)添加水平下，樣品的加標(biāo)回收率分別為99.5%，99.9%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.1%（n=6）。改進(jìn)后的方法準(zhǔn)確、可靠，可用于酒類產(chǎn)品中甜蜜素的定量定性檢驗(yàn)。

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法；酒類；甜蜜素

甜蜜素在食品添加劑中屬于甜味劑，其化學(xué)名稱為環(huán)己基氨基磺酸納，其甜度是蔗糖的30～40倍，過(guò)量攝入會(huì)對(duì)人體的肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)造成危害。2011年我國(guó)發(fā)布實(shí)施的《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》［1］中對(duì)于配制酒規(guī)定了其最大使用量為0.65 g／kg，同時(shí)白酒的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)明確要求“不得添加非白酒發(fā)酵產(chǎn)生的呈香呈味物質(zhì)”［2-4］，但是個(gè)別生產(chǎn)企業(yè)為了改善酒體的口感，仍然在生產(chǎn)過(guò)程中違規(guī)或過(guò)量地使用甜蜜素。因?yàn)榘拙浦泻协h(huán)己基和環(huán)乙醇類物質(zhì)，使用GB／T 5009.97-2003 《食品中環(huán)己基氨基磺酸納》氣相色譜法檢測(cè)白酒中環(huán)己基氨基磺酸納容易出現(xiàn)假陽(yáng)性，用液相色譜法檢測(cè)比較簡(jiǎn)單，但是甜蜜素對(duì)紫外吸收差，在不衍生的情況下難以測(cè)定［5］。筆者在采用 SN／T 1948-2007［6］檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)該標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于酒類樣品前處理和確證方面存在一些問(wèn)題，因此探討并摸索出一種檢測(cè)靈敏度高，能有效去除干擾的檢測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent 1260型，配備Agilent在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱，美國(guó)安捷倫儀器公司；

質(zhì)譜儀：Agilent 6430型，配備電噴霧離子源，三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，美國(guó)安捷倫儀器公司；

高純氮?dú)猓杭兌炔坏?9.999%；

氮吹儀：N-EVAPⅢ型，美國(guó)Organomation公司；

甲醇：色譜純；

甲酸：純度不低于98.0%；

甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：純度不低于99.9%；

實(shí)驗(yàn)用水：屈臣氏蒸餾水。

1.2 液相色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18型（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液-甲醇（體積比80∶20），流速為0.3 mL／min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI）；負(fù)離子模式；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；負(fù)電壓：400；霧化氣壓力：275.8 kPa(40 psi)；干燥氣體流速：10 L／min；干燥器溫度：350℃；毛細(xì)管電壓：4 000 V；甜蜜素的定性定量離子對(duì)、碎裂電壓、碰撞氣能量等參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 甜蜜素監(jiān)測(cè)離子及相應(yīng)的碰撞能量

1.4 樣品處理

準(zhǔn)確移取2.0 mL樣品并準(zhǔn)確稱量，置于30℃水浴中氮吹至乙醇揮發(fā)干凈，用蒸餾水轉(zhuǎn)移定容至2.0 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后待測(cè)。

1.5 實(shí)驗(yàn)步驟

（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

準(zhǔn)確稱取0.02 g的甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用蒸餾水溶解定容至100.0 mL，得到濃度為200 μg／mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。準(zhǔn)確移取1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)貯備液用蒸餾水稀釋定容至100.0 mL，配制成濃度為2 000 ng／mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液，再逐級(jí)稀釋得到濃度在10～100 ng／mL之間的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

（2）樣品測(cè)定

在1.2、1.3儀器條件下，分別取處理后的樣液和系列標(biāo)準(zhǔn)使用液各10 μL進(jìn)行測(cè)定。甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流（TIC）色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流色譜圖

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理

液相色譜進(jìn)行分離時(shí)，酒類樣品中含有的大量乙醇對(duì)甜蜜素在色譜柱上的保留造成影響，干擾峰和目標(biāo)峰分離不開(kāi)，導(dǎo)致積分不準(zhǔn)確，因此要通過(guò)加熱氮吹的方式趕除樣品中揮發(fā)性醇類物質(zhì)。圖2和圖3分別為未經(jīng)預(yù)處理和經(jīng)預(yù)處理樣品的色譜圖。從圖2、圖3中可以看出，未經(jīng)處理的樣品在目標(biāo)峰附近干擾嚴(yán)重，影響積分；而趕除醇類后的樣品峰形良好。SN／T 1948-2007標(biāo)準(zhǔn)中未明確酒類樣品的取樣質(zhì)量問(wèn)題，以幾種白酒為例，經(jīng)實(shí)際稱量得知2 mL的白酒實(shí)際質(zhì)量均不到2 g，因此在計(jì)算時(shí)，以樣品的實(shí)際質(zhì)量而非體積參與計(jì)算。

圖2 未經(jīng)預(yù)處理樣品色譜圖

圖3 經(jīng)預(yù)處理樣品的色譜圖

2.2 色譜條件的選擇

不同的檢驗(yàn)室配置的設(shè)備型號(hào)各有不同，因此只有摸索出適合本實(shí)驗(yàn)室設(shè)備的最佳儀器條件才能保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。在此實(shí)驗(yàn)中，考察了標(biāo)準(zhǔn)給出的流動(dòng)相組成0.1%乙酸水溶液-甲醇（體積比40∶60），同時(shí)考察了文獻(xiàn)報(bào)道的 0.02 mol／L［7］乙酸銨緩沖液-乙腈（體積比90∶10）、0.1%甲酸水溶液-甲醇（體積比80∶20）兩種體系的流動(dòng)相組成，發(fā)現(xiàn)0.1%甲酸水溶液-甲醇（體積比80∶20）的組成能夠得到更好的峰形和接近一倍的響應(yīng)值，因此選擇其作為流動(dòng)相。同時(shí)選擇了長(zhǎng)度為50 mm的色譜柱，在2 min之內(nèi)即能完成單個(gè)樣品的檢測(cè)，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間。

2.3 質(zhì)譜條件的選擇

首先選擇全掃描模式找到甜蜜素的母離子m／z178.1，然后用子離子掃描模式得到子離子m／z80.1，因?yàn)榱呀鈺r(shí)只得到一個(gè)碎片離子，因此將178.1也作為子離子。通過(guò)調(diào)整駐留時(shí)間、裂解電壓和碰撞氣能量得到較高的靈敏度，確定最佳實(shí)驗(yàn)條件。標(biāo)準(zhǔn)指出確證時(shí)用正負(fù)離子模式同時(shí)掃描，實(shí)際檢測(cè)正離子模式響應(yīng)較差，因此筆者采用負(fù)離子模式。

2.4 工作曲線方程和檢出限

實(shí)驗(yàn)表明，在10～100 ng／mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)以峰面積y為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度x為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得線性方程為y=2 157.816 864x-4 379.373 265，相關(guān)系數(shù)r=0.999 6。以信噪比S／N≥3時(shí)計(jì)算方法的檢出限為0.01 mg／kg，比SN／T 1948-2007標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的0.10 mg／kg的測(cè)定下限降低了一個(gè)數(shù)量級(jí)。

2.5 回收試驗(yàn)和精密度試驗(yàn)

采用在空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法進(jìn)行回收試驗(yàn)，兩個(gè)質(zhì)量濃度添加水平分別為10，20 ng／mL，加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。同時(shí)對(duì)添加水平為10 ng／mL的樣品重復(fù)測(cè)定6次，測(cè)試結(jié)果分別為 9.986 1，9.980 2，9.991 2，9.990 9，9.979 8，9.987 9 ng／mL，計(jì)算得測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.1%。

表2 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果(n=2)

樣品未經(jīng)處理直接進(jìn)樣，按上述方法進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。10 ng／mL的樣品重復(fù)測(cè)定 6 次，測(cè)試結(jié)果分別為 6.621 7，5.864 4，5.371 1，5.001 9，4.749 9，4.608 9 ng／mL，計(jì)算得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為14.2%。

表3 未經(jīng)處理樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果(n=2)

由此可見(jiàn)，樣品處理方法經(jīng)改進(jìn)后得到的測(cè)量數(shù)據(jù)的精密度和準(zhǔn)確度均有很大程度的提高，測(cè)定結(jié)果良好。

3 結(jié)語(yǔ)

對(duì)SN／T 1948-2007標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行改進(jìn)，改進(jìn)后的方法能有效排除干擾，具有較高的靈敏度，且方法的準(zhǔn)確度和精密度均有很大程度提高，適用于酒類樣品的分析檢測(cè)。

［1］GB 2760-2011 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)［S］.

［2］GB／T 10781.1-2006 濃香型白酒［S］.

［3］GB／T 10781.2-2006 清香型白酒［S］.

［4］GB／T 10781.3-2006 米香型白酒［S］.

［5］鄭玲，李麗華，郭蔚，等.高效液相色譜法測(cè)定食品中的甜蜜素［J］.化學(xué)分析計(jì)量，2005(3)： 50-51.

［6］SN／T 1948-2007 進(jìn)出口食品中環(huán)己基氨基磺酸納的檢驗(yàn)方法 液相色譜-質(zhì)譜／質(zhì)譜法［S］.

［7］盛旋，陳昌駿，丁振華，等.固相萃取-液相色譜／質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定食品中磺胺類人工合成甜味劑［J］.分析實(shí)驗(yàn)室，2006，25(7)：75-78.

Discussion and Improvement for Determination of Sodium Cyclamate in Alcohol by Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

Wang Qun，Ding Yichong
(Fuyang Institute of Product Quality Supervision & Inspection，F(xiàn)uyang 236000，China)

The problems of SN／T 1948-2007Determination of Sodium Cyclamate in Foods for Import and Export-HPLC-MS／MSmethodwere discussed and improved. The ethanol in sample was removed by nitrogen evaporator and the samples were separated by C18chromatographic column with 0.1% formic acid-methanol as mobile phase and ESI negative ion mode detection. Sodium cyclamate content had good relationship with peak area in the range of 10-100 ng／mL，the correlation coefficientr=0.999 6. The detection limit was 0.01 mg／kg. The recovery was 99.5%-99.9%，and the relative standard deviation of determination results was 0.1%(n=6). The improved method is accurate and reliable，it can be used for quantitative and qualitative test of sodium cyclamate in liquor products.

liquid chromatography tandem mass spectrometry; liquor; sodium cyclamate

O657.7

A

1008-6145(2012)04-0062-03

10.3969／j.issn.1008-6145.2012.04.019

聯(lián)系人：王群；E-mail：ahdyc@163.com

2012-04-16