畢健琨，任 偉,鄭曉雅,許 丹

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科 400016)

2型糖尿病(T2DM)屬于復(fù)雜的多基因疾病，遺傳因素與環(huán)境因素共同參與發(fā)病過程。2006年首次報道TCF7L2，即T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子-4(TCF-4)單核苷酸多態(tài)性與T2DM顯著相關(guān)[1]，Weedon等[2]認(rèn)為TCF7L2 rs7903146位點基因變異型是目前發(fā)現(xiàn)的和T2DM發(fā)病風(fēng)險相關(guān)性最強(qiáng)的基因型。隨后在多范圍大樣本的研究中得到類似的結(jié)果。TCF7L2位于染色體10q25.3，表達(dá)產(chǎn)物是高遷移率(HMG)組盒包含的1個轉(zhuǎn)錄因子。TCF7L2是T細(xì)胞因子/淋巴細(xì)胞增強(qiáng)子結(jié)合因子(TCF/LEF)之一。

GPR40是G蛋白偶聯(lián)受體家族(GPCRs)成員之一。它在腦、胰腺、肝、心臟、骨骼肌等均有表達(dá)[3-4]，尤其在胰島、腦組織中表達(dá)豐富。GPR40是脂肪酸的特異性受體，脂肪酸作為胞外配體，活化GPR40，激活胰島β細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，調(diào)節(jié)胰島素分泌。GPR40在脂肪酸增強(qiáng)GSIS和促進(jìn)胰島β細(xì)胞過度增殖，進(jìn)而在引起胰島β細(xì)胞功能缺陷中扮演重要角色。2007年，Reut等[5]發(fā)現(xiàn)GPR40與轉(zhuǎn)錄因子PDX-1存在特異性結(jié)合位點，但是GPR40是否與轉(zhuǎn)錄因子TCF7L2存在結(jié)合位點，目前尚不清楚。

在后基因組時代，DNA-蛋白質(zhì)的相互作用是研究基因表達(dá)調(diào)控的重要領(lǐng)域。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(chromatin immunoprecipitation，CHIP)，是一種在體內(nèi)研究DNA-蛋白質(zhì)相互作用的理想方法，利用抗原抗體反應(yīng)的特異性以及PCR的高靈敏性，可以真實地反映體內(nèi)蛋白因子與基因組結(jié)合的狀況，已成為染色質(zhì)水平基因表達(dá)調(diào)控研究的最有效方法。本研究擬通過CHIP技術(shù)探討GPR40蛋白與TCF7L2基因是否存在相互作用。

1 材料與方法

1．1材料

1．1．1細(xì)胞株 胰島βTC6細(xì)胞購買于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1．1．2主要試劑和儀器 PAA胎牛血清(德國德圖)，DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，TCF7L2的抗體為兔抗人TCF7L2單克隆抗體C9B9(美國Cell signaling technology)，PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成。CHIP試劑盒為美國Millipore公司magna chipTMA。超聲破碎儀為美國Sonic公司VC750型，PCR儀為美國MJ公司 PTC-200型。

1．2方法

1．2．1胰島βTC6細(xì)胞的培養(yǎng)及細(xì)胞的甲醛交連 胰島βTC6細(xì)胞用含20%的胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液在37 ℃，5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，2 d換液，7 d傳代1次。實驗時取對數(shù)生長期細(xì)胞。取1培養(yǎng)皿細(xì)胞(10 cm培養(yǎng)皿)，吸掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，加入10 mL 1%甲醛，37 ℃孵育10 min。加入1.25 mol/L甘氨酸1 mL，至終濃度為125 mmol/L，室溫下放置2 min。棄上清液，用1 mL冷PBS刮細(xì)胞，移至1.5 mL的EP管中，2 500 r/min離心5 min，棄上清，加入800 μL PBS，4 ℃預(yù)冷15 min，然后4 ℃ 2 500 r/min離心5 min，重復(fù)PBS清洗1遍。然后用包含10 mmol/L HEPES pH7.5，10 mmol/L EDTA，0.5 mmol/L EGTA，0.75% Triton X-100的溶液清洗細(xì)胞一遍，再用包含10 mmol/L HEPES pH7.5，200 mV Nacl，1 mmol/L EDTA,0.5 mmol/L EGTA的溶液清洗細(xì)胞一遍。

1．2．2超聲破碎 在樣品中加入1 mL的lysis buffer(150 mmol/L Nacl 1% Triton X-100,25 mmol/L Tris pH7.5,0.1%SDS,0.5%脫氧膽酸鹽),充分混勻，超聲震蕩，30%功率震蕩強(qiáng)度(10 s+60 s)×10次，4 ℃ 2 500 r/min離心5 min，取上清，測蛋白濃度。

1．2．3檢驗超聲破碎效果 取100 μL超聲破碎后產(chǎn)物，加入4 μL 5 mol/L NaCl，65 ℃處理2 h解交聯(lián)。分出一半用氯仿抽提。電泳檢測超聲破碎后的效果。

1．2．4免疫沉淀 取200～500 μg蛋白，加入80 μL蛋白A瓊脂糖/鮭精DNA，室溫下放置30 min。4 ℃ 2 500 r/min離心5 min，留蛋白上清總體積的10% 作為input，然后將剩余上清分成2份，分別加目的TCF7L2抗體、陽性對照乙?；M蛋白H3抗體和陰性對照IgG。4 ℃ 150 r/min放搖床過夜。次日早晨，每樣品加入60 μL蛋白A瓊脂糖/鮭精DNA，4 ℃放置4 h，4 ℃ 2 500 r/min離心5 min，棄上清液。每管加入500 μL RIPA buffer(150 mmol/L Nacl，50 mmol/L Tris-HCl pH8，0.1% SDS，0.5% Deoxycholat，1 mmol/L EDTA，1% NP-40)，4 ℃放置15 min，4 ℃ 2 500 r/min離心5 min，棄上清液。分別用預(yù)冷high salt buffer(50 mmol/L Tris-Hcl pH8，0.1% SDS，0.5% Deoxycholate，1 mmol/L EDTA，1% NP-40，500 mmol/L Nacl)和LiCl buffer(50 mmol/L Tris-Hcl pH8，250 mmol/L Licl，0.1% SDS，0.5% Deoxycholate，1% NP-40，1 mmol/L EDTA)洗膠一遍，用預(yù)冷TE buffer(10 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA)洗膠2遍，棄上清液。

1．2．5蛋白質(zhì)/DNA復(fù)合物的洗脫及DNA的去交聯(lián) 向膠中加入250 μL Elution buffer(1% SDS，0.1 mol/L NaHCO3)，室溫放置15 min，2 500 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液至新EP管，重復(fù)洗一遍。取上清液(500 μL)于新EP管，加20 μL Nacl(5 mol/L)，混勻，input加Elution Buffer補(bǔ)體積至500 μL，再加20 μL Nacl(5 mol/L)(如：100 μL input+4 μL Elution Buffer+20 μL 5 mol/L Nacl)一起65 ℃水浴過夜。取出置室溫，加入2 μL ProteinaseK(10 mg/mL)，45 ℃水浴1 h。加入等體積(520 μL)氯仿，劇烈震蕩10 s，室溫，12 000 r/min離心1 min，將含DNA上層400 μL移入新管中，加1/10體積即40 μL 3 mol/L乙酸鈉，稍加震蕩，加2體積即800 μL 100%預(yù)冷乙醇，加1 μL(20 μg) 糖原，震蕩混勻，置-30 ℃過夜，充分沉淀DNA。12 000 r/min離心10 min。加入1 mL 70% 乙醇，混勻，12 000 r/min離心5 min，棄上清液，室溫干燥至少30 min。加入dH20 50～100 μL， 65 ℃水浴至少30 min。洗脫后的DNA即可進(jìn)行PCR檢測。

1．2．6PCR及瓊脂糖凝膠電泳檢測 設(shè)計GPR40基因引物為5′-CTC ACA GTC CTC CCA GGG TC-3′，5′-CTT CAG TGC GAC ATC GTC TT-3′，預(yù)計擴(kuò)增長度為155 bp。擴(kuò)增體系為10 μL，PCR Mix 5 μL，超純水3 μL，DNA模板1 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL。擴(kuò)增條件，94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25個循環(huán)后72 ℃延伸7 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取4 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，觀察并分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2．1胰島βTC6細(xì)胞株核染色質(zhì)切割有效性的確定 為了得到合適大小的DNA片段，摸索了不同的超聲功率，超聲時間的超聲破碎條件，最終得到了合適的條件，使得DNA片段長度為100～1 000 bp(圖1)。

2．2TCF7L2抗體免疫沉淀DNA模板的PCR擴(kuò)增結(jié)果檢測 陽性對照乙?；M蛋白H3抗體免疫沉淀的DNA為模板，陰性對照以IgG抗體免疫沉淀的DNA為模板，陽性對照條帶清晰明亮。而陰性對照看不見擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果說明實驗中沉淀可信。以TCF7L2抗體免疫沉淀的染色質(zhì)片斷提取的DNA為模板，PCR擴(kuò)增GPR40，結(jié)果顯示模板中含有被擴(kuò)增區(qū)段的DNA(圖2)。

1：對照(未超聲破碎);2、3：超聲打斷后的染色質(zhì)。

1：乙?；M蛋白H3抗體免疫沉淀的DNA;2：TCF7L2抗體免疫沉淀的DNA;3：羊抗人IgG抗體免疫沉淀的DNA;4：DEPC水;M:DNA Marker。

3 討 論

染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)是基于體內(nèi)分析發(fā)展起來的方法，已經(jīng)成為表觀遺傳信息研究的主要方法。它能夠較真實地反映體內(nèi)狀態(tài)下染色質(zhì)與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的結(jié)合情況[6]。這種方法與DNA芯片與分子克隆技術(shù)相結(jié)合，可用于高通量的篩選已知蛋白因子的未知DNA靶點和研究反式作用因子在整個基因組上的分布情況，這將有助于深入了解DNA-蛋白質(zhì)相互作用的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[7]。

染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)雖然在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮了越來越重要的作用，但是該技術(shù)操作繁瑣、復(fù)雜，實驗操作對實驗結(jié)果影響較大，其中DNA片段的大小對實驗結(jié)果起著較大的影響[8]。DNA片段較大，不利于區(qū)分染色質(zhì)上結(jié)合有目的蛋白和沒有結(jié)合目的蛋白的區(qū)域，DNA片段較小不利于PCR擴(kuò)增。因此，適當(dāng)?shù)腄NA片段大小對于染色質(zhì)免疫沉淀的結(jié)果非常重要，一般認(rèn)為100～1 000 bp的長度范圍是比較合適的。此外，用于染色質(zhì)免疫沉淀的抗體的質(zhì)量直接決定實驗的成敗，一般用于免疫組化和Westeren blotting的抗體不適合用于做染色質(zhì)免疫沉淀，染色質(zhì)免疫沉淀需要更高特異性的抗體?？贵w的用量也特別重要，抗體用量過多可能會沉淀某些非特異性蛋白，抗體用量過少則特異蛋白沉淀不完全，適宜的抗體量是剛好沉淀經(jīng)超聲剪切的特異性蛋白[9]。只有優(yōu)化各種實驗條件，才能得到較滿意的染色質(zhì)免疫沉淀的實驗結(jié)果。

胰島β細(xì)胞通過分泌適量的胰島素來維持機(jī)體的需要，這對保持機(jī)體的代謝平衡起到了決定性的作用。胰島素的分泌主要取決于血糖的波動，同時，營養(yǎng)因素，神經(jīng)傳導(dǎo)作用以及激素的相互作用均對胰島素的分泌產(chǎn)生影響[10]。為了實現(xiàn)其重要的生理作用，胰島β細(xì)胞對某些在該細(xì)胞中選擇表達(dá)的基因進(jìn)行調(diào)控，對這些基因的調(diào)控是通過轉(zhuǎn)錄控制機(jī)制來完成的[11]，這涉及普遍存在的整合機(jī)制以及細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子[12]。GPR40基因選擇性地表達(dá)在胰島β細(xì)胞，它對胰島素分泌起到了重要作用。

研究證實TCF7L2與GPR40與T2DM顯著相關(guān)。轉(zhuǎn)錄因子TCF7L2可以通過改變Wet信號途徑來直接影響胰島β細(xì)胞的生物學(xué)功能，而且TCF7L2也可以間接引起腸胰島軸的功能缺陷，包括GLP-1的分泌減少和GLP-1所誘導(dǎo)的胰島素分泌缺陷和(或)功能障礙。但是，GPR40是通過何種途徑調(diào)節(jié)胰島素的分泌以及胰島β細(xì)胞功能目前尚不清楚。Del Guerra等[13]研究發(fā)現(xiàn)脂肪酸調(diào)節(jié)了人類胰島中的GPR40的表達(dá)，T2DM患者胰腺中的GPR40的表達(dá)量較正常人少，胰島素的分泌以及胰島β細(xì)胞功能的異常均與GPR40有關(guān)。Kebede等[14]認(rèn)為GPR40不僅能夠在脂肪酸刺激的胰島素分泌中起作用，而且在高脂飲食的情況下對葡萄糖刺激的胰島素分泌也起作用。Naqasumi等[15]研究發(fā)現(xiàn)GPR40可以調(diào)節(jié)葡萄糖刺激的胰島素分泌以及體內(nèi)的血漿葡萄糖水平，同時可以提高普通小鼠以及糖尿病小鼠的糖耐量。Thierry等[16]研究發(fā)現(xiàn)GPR40的缺失可以降低胰島素的分泌，其機(jī)制并不是通過影響脂肪酸刺激的胰島素分泌，而是減少了葡萄糖以及精氨酸刺激的胰島素分泌，其機(jī)制是通過影響肌醇磷酸類的產(chǎn)生。Pang等[17]則認(rèn)為GPR40介導(dǎo)的胰島素的分泌，部分是由于刺激了腎上腺素受體所引起的。然而GPR40基因啟動子是否與轉(zhuǎn)錄因子TCF7L2相互結(jié)合，從而影響胰島素的分泌，目前未見相關(guān)報道。

已經(jīng)證實GPR40與轉(zhuǎn)錄因子PDX-1存在特異性結(jié)合位點。為了探討轉(zhuǎn)錄因子TCF7L2是否對GPR40基因直接起作用，本研究以TCF7L2抗體免疫沉淀TCF7L2結(jié)合的染色質(zhì)片段，PCR擴(kuò)增出GPR40基因，該結(jié)果證實TCF7L2可與GPR40基因調(diào)控區(qū)結(jié)合，為TCF7L2參與GPR40表達(dá)調(diào)控提供了強(qiáng)有力的證據(jù)。本研究為GPR40如何參與胰島素分泌找到了新的依據(jù)。但是TCF7L2是如何參與GPR40表達(dá)調(diào)控還需進(jìn)一步研究。

[1]Grant SF,Thorleifsson G,Reynisdottir I,et al.Variant of transcription factor 7-like 2(TCF7L2) gene confers risk of type 2 diabetes[J].Nat Genet，2006，38:320-323.

[2]Weedon MN,Mc Carthy MI,Hitman G,et al.Combining information from common type 2 diabetes risk polymorphism improves disease prediction[J].Plos Med，2006，3:e347-351.

[3]Kotarsky K,Nilsson NE,Flodgren E,et al.A human cell surface receptor activated by free fatty acids and thiazolidinedione drugs[J].Biochem Biophys Res Commun,2003,301:406-410.

[4]Briscoe CP,Tadayyon M,Andrews JL,et al.The orphan G protein-coupled receptor GPR40 is activated by medium and long chain fatty acids[J].J Biol Chem,2003,278:11303-11311.

[5]Reut BS,Gabried R,Bahar K,et al.Regulation of the gene encoding GPR40,a fatty aid receptor expressed selectively in pancreatic β cells[J].J Biol Chem，2007，282(32):23561-23571.

[6]Weinmann AS,Farnham PJ.Identification of unknown target genes of human transcription factors using chromatin immunoprecipitation[J].Methods，2002，26(1):37-47.

[7]王春雨，石建黨，朱彥,等.染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)在研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用中的應(yīng)用[J].遺傳，2005，27(5)：801-807.

[8]Kuo MH，Allis CD.In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic protein:DNA association in a chromatin environment[J].Methods,1999,19(3):425-433.

[9]Hecht A,Grunstein M.Mapping DNA interaction sites of Chromosomal proteins using immunoprecipitation and polymerase chain reaction[J].Methods Enzymol，1999，304:399-414.

[10]Henquin JC,Ravier MA,Nenquin M,et al.Hierarchy of the beta-cell signals controlling insulin secretion[J].Eur J Clin Invest，2003，33(9):742-750.

[11]German M,Ashcroft S,Docherty K,et al.The insulin gene promoter.a simplified nomenclature[J].Diabetes，1995，44(8):1002-1004.

[12]Wilson ME,Scheel D,German MS.Gene expression cascades in pancreatic development[J].Mech Dev，2003，120(1):65-80.

[13]Del Guerra S，Bugliani MD,Aleo V，et al.G-protein-coupled receptor(GPR40) expression and its regulation in human pancreatic islets:the role of type 2 diabetes and fatty acids[J].Nutr Metab Cardivas Dis，2010,20(1):22-25.

[14]Kebede M,Alquier T,Latour MG,et al.The fatty acid receptor GPR40 plays a role in insulin secretion in vivo after high-fat feeding[J].Diabetes，2008，57(9):2432-2437.

[15]Naqasumi K,Esaki R,Lwachidow K,et al.Overexpression of GPR40 in pancreatic beta-cells augments glucose - stimulated insulin section and improve glucose tolerance in normal and diabetic mice[J].Diabetes,2009，58(5):1067-1076.

[16]Thierry A,Marie-Line P,Martin G,et al.Deletion of GPR40 impairs glucose-induced insulin secretion in vivo in mice without affecting intracellular fuel metabolism in islets[J].Diabetes，2009，58(11):2607-2615.

[17]Pang Z,Wu Z,Zhang X,et al.GPR40 is partially required for insulin secretion following activation of beta 3-adrenergic receptors[J].Mol Cell Endocrinol，2010，325(1-2):18-25.