陳桂蘭，陸 燕

(廣西壯族自治區(qū)來賓市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 546100)

HBsAg為HBV感染的最主要病原標(biāo)志和直接證據(jù)之一,目前中國大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)及膠體金法進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于HBsAg低濃度的標(biāo)本，檢測(cè)時(shí)常因方法學(xué)的原因造成靈敏度較低,導(dǎo)致臨床出現(xiàn)漏檢等問題。光激化學(xué)發(fā)光免疫分析法(light initiated chemiluminescence assay,LICA)始于20世紀(jì)90年代問世的單線態(tài)氧分子能量傳遞發(fā)光免疫分析技術(shù)(luminescent oxygen channeling immunoassay，LOCI)，經(jīng)過長時(shí)間的發(fā)展，國內(nèi)已成功研制了基于LOCI檢測(cè)原理的LICA及檢測(cè)設(shè)備和相關(guān)試劑。本文使用LICA、ELISA及膠體金法同時(shí)測(cè)定經(jīng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析法(ECLIA)篩選的HBV定量檢測(cè)陽性膠體金法標(biāo)本吸光度與儀器所給臨界值(Cut-off)的比值(COI)為1～50的臨床標(biāo)本80例,HBsAg COI<1的臨床標(biāo)本30例作為陰性對(duì)照，以廣西壯族自治區(qū)臨檢中心提供的臨界值控制品作為質(zhì)控，現(xiàn)將評(píng)價(jià)效果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 80份經(jīng)羅氏ECLIA篩選HBsAg COI 為1～50的低濃度臨床標(biāo)本來自本院門診及住院患者(觀察組)，乙型肝炎(簡稱乙肝)患者診斷符合國家標(biāo)準(zhǔn)。30份正常人血清來自本院健康體檢者(對(duì)照組)。

1.2方法

1.2.1儀器及試劑 LICA HT 高通量免疫分析儀、LICA SP 全自動(dòng)移液器以及試劑盒由上海博陽生物科技(上海)有限公司提供；羅氏COBAS e601電化學(xué)發(fā)光分析儀及配套試劑由瑞士羅氏公司提供；ELISA HBsAg試劑盒由英科新創(chuàng)(廈門)公司提供,Biocell- 2010酶標(biāo)儀由博賽公司提供、BIO-RAD 1575洗板機(jī)由伯樂公司提供；膠體金法試劑由杭州艾康公司提供。廣西壯族自治區(qū)臨檢中心提供的臨界值控制品濃度為1 ng/mL。標(biāo)準(zhǔn)品為美國Abbott公司提供，血清定值為HBsAg 1 ng/mL。

1.2.2測(cè)定方法 (1) LICA測(cè)定HBsAg的含量采用雙抗體夾心法，基礎(chǔ)原理是一種均相免疫反應(yīng)：均相條件下，將試劑1(R1，內(nèi)部帶有染料的納米感光微粒)、試劑2(R2，內(nèi)部帶有發(fā)光化合物、包被有活性分子的納米發(fā)光微粒)與待測(cè)樣本進(jìn)行混合。此時(shí)R1中的感光微粒和R2中的發(fā)光微粒可快速有效地捕捉待測(cè)物質(zhì)，形成免疫復(fù)合物。復(fù)合物經(jīng)過680 nm激發(fā)光照射后，感光微粒中的染料被誘導(dǎo)激活，并釋放出高能態(tài)的單線態(tài)氧，而單線態(tài)氧能被近距離(200 nm)的發(fā)光微粒所俘獲，發(fā)光微粒進(jìn)而釋放出高能級(jí)的紅光(610 nm)，通過單光子計(jì)數(shù)器和數(shù)學(xué)擬合將光子數(shù)換算為靶分子濃度。當(dāng)樣本不含待測(cè)物質(zhì)時(shí)，兩種微粒間則無法形成免疫復(fù)合物，單線態(tài)氧在液相中迅速衰減，無法傳遞至發(fā)光微粒表面，檢測(cè)時(shí)則無光子產(chǎn)生。(2) 羅氏ECLIA全自動(dòng)儀器操作按照廠家說明書及科室的儀器標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)文件規(guī)定進(jìn)行。(3) ELISA法嚴(yán)格按照廈門英科新創(chuàng)公司提供的說明書進(jìn)行。(4) 膠體金法嚴(yán)格按艾康公司提供的說明書進(jìn)行。

1.2.3結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) 按照試劑盒說明，LICA>0.2 ng/mL可判斷為陽性，ECLIA COI>1可判斷為陽性，ELISA當(dāng)OD/CO>1可判斷為陽性，膠體金法出現(xiàn)2條帶時(shí)可判斷為陽性。

1.2.4評(píng)價(jià)方法 (1)靈敏度比較：標(biāo)準(zhǔn)品(HBsAg濃度1 ng/mL)用PBS-BSA液倍比稀釋至0.5、0.25、0.12、0.06、0.03 ng/mL等已知濃度系列樣品，分別使用LICA、ECLIA、 ELISA及膠體金法重復(fù)測(cè)定2次，比較各方法間的靈敏度。(2)精密度比較：對(duì)處于臨界值的質(zhì)控品連續(xù)檢測(cè)5 d。每天2批，每批各重復(fù)5次，計(jì)算平均批內(nèi)變異系數(shù)(CV)。由于膠體金法僅判斷為陽性、弱陽性和陰性，本文對(duì)膠體金法的精密度不進(jìn)行討論。(3)4種方法檢測(cè)HBsAg的比較：以ECLIA為比較對(duì)象，分析LICA、ELISA和膠體金法檢測(cè)兩組的樣本，比較檢出率和符合率。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，對(duì)ECLIA、LICA和ELISA 3種方法檢測(cè)HBsAg的結(jié)果采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.14種檢測(cè)方法測(cè)定HBsAg的靈敏度比較 HBsAg濃度為0.12 ng/mL 時(shí)ECLIA為陽性(COI>1)；HBsAg濃度為0.25 ng/mL時(shí)LICA為陽性；HBsAg濃度為0.50 ng/mL時(shí)ELISA為陽性(OD/CO>1)；HBsAg 濃度為1.00 ng/mL 膠體金法為陽性(試紙條出現(xiàn)2條紅色帶時(shí))。見表1。

表1 4種方法測(cè)定HBsAg的靈敏度比較(ng/mL)

2.2ECLIA、LICA和ELISA 3種方法的CV比較 ECLIA、LICA和ELISA平均濃度分別為7.11±3.69(COI)、(1.08±0.57 )ng/mL和4.56±2.24(OD/CO)，CV分別為7.8%、8.6%和11.9%。

2.34種方法測(cè)定HBsAg結(jié)果比較 4種方法檢測(cè)兩組樣本，以ECLIA法作比較，其中LICA檢出率為98.7%，ELISA 法檢出率為93.7%，膠體金法檢出率僅為25.0%，見表2。

表2 4種方法HBsAg測(cè)定結(jié)果比較

3 討 論

HBsAg是檢測(cè)HBV首選的免疫學(xué)標(biāo)志物，膠體金法和ELISA兩步法檢測(cè)HBsAg，在國內(nèi)已被廣泛采用，ELISA兩步法雖在一定程度上能杜絕鉤狀效應(yīng)(Hook效應(yīng))，但同時(shí)也可因靈敏度較低(<0.5 ng/mL)而出現(xiàn)漏檢，而且ELISA方法由于要分離結(jié)合態(tài)的抗原(或抗體)與游離態(tài)的抗原(或抗體)，因此需要反復(fù)加樣和洗板，引入的誤差加大，加上酶標(biāo)板的孔間存在差異等問題一直導(dǎo)致該法精密度較差。本次結(jié)果中，ELISA法的CV是11.9%，分析原因可能是由于選用了較低值的質(zhì)控品(1 ng/mL)進(jìn)行評(píng)價(jià)；對(duì)于低濃度的HBsAg標(biāo)本(COI 1～50)，也因?yàn)榉椒`敏度較低而出現(xiàn)假陰性[1]，本實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)5例假陰性；膠體金法雖然操作簡單、方便，但由于其方法學(xué)的原因靈敏度更低，同樣對(duì)低濃度HBsAg檢測(cè)會(huì)產(chǎn)生假陰性結(jié)果[2]。

而ECLIA是近年來繼熒光免疫法(FIA)、放射免疫法(RIA)和酶聯(lián)免疫法(EIA)之后發(fā)展起來的新興免疫標(biāo)記技術(shù)，該技術(shù)使用的標(biāo)記物穩(wěn)定，無放射性污染，已發(fā)展成為國外檢測(cè)病毒性肝炎血清學(xué)指標(biāo)的重要方法[3]。與ELISA和膠體金法比較，ECLIA試劑的優(yōu)勢(shì)在于其不僅具有較高的靈敏度，而且還具有更寬的線性范圍[4-5]。但是該方法所需儀器和試劑成本較高,不適宜在基層地方推廣。

LICA技術(shù)使用了納米級(jí)顆粒，增加了生物分子的包被面積，同時(shí)借助鏈霉親和素-生物素放大系統(tǒng)，極大地提高了檢測(cè)靈敏度，減少樣本和試劑的用量，它避免了傳統(tǒng)檢測(cè)方法中繁瑣的分離和洗滌步驟，有效降低了檢測(cè)背景值，減少了反應(yīng)時(shí)間，并可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作[1,6-7]。目前還沒有應(yīng)用該原理的進(jìn)口試劑，而國內(nèi)已經(jīng)研制了與該方法配套的檢測(cè)病毒性肝炎標(biāo)志物和相關(guān)腫瘤標(biāo)志物的全自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)。本文使用LICA對(duì)HBsAg的檢測(cè)結(jié)果顯示，LICA對(duì)HBsAg的分析靈敏度可達(dá)到0.25 ng/mL，80例陽性樣本中僅1例未檢出，與ECLIA測(cè)定結(jié)果最為相近。

本文對(duì)80例HBsAg低濃度標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果顯示，ELISA與膠體金法的漏檢率為6.3%和75.0%，對(duì)低濃度樣品易漏檢，且無法得知被測(cè)物真正的濃度，給臨床診斷和治療帶來許多不便。HBV血清標(biāo)志物定量檢測(cè)能較為準(zhǔn)確地反映其血清中的含量，對(duì)臨床藥物療效評(píng)價(jià)具有重要意義[8]。而LICA和ECLIA均可對(duì)HBsAg進(jìn)行定量。本實(shí)驗(yàn)中LICA和ECLIA檢出相符性很高，兩種方法檢測(cè)結(jié)果的符合率高達(dá)99.09%，對(duì)HBsAg的陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明使用LICA可以在常規(guī)臨床檢測(cè)中替代ECLIA用于HBsAg定量檢測(cè)。雖然對(duì)普通人群進(jìn)行初篩時(shí)，檢測(cè)方法使用高靈敏度方法進(jìn)行檢測(cè)是否存在醫(yī)療過度的問題尚存在爭議，但由于LICA已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了儀器和試劑的國產(chǎn)化，成本較低，可以有效降低醫(yī)療費(fèi)用。與ECLIA相比，LICA具備相近的檢測(cè)性能，但可控制成本；與ELISA及膠體金法比較，LICA具有更高的敏感度并可簡化操作步驟，使實(shí)驗(yàn)更快捷，且該法可進(jìn)行自動(dòng)化定量檢測(cè)，可動(dòng)態(tài)觀察療效和監(jiān)測(cè)病情，適于臨床使用。

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