柳光芬

(重慶消防總隊醫(yī)院檢驗科 400060)

動粒(kinetochore)又稱著絲粒點(centromeric dots，Cd),是細(xì)胞分裂前/中期維系姐妹染色單體的重要結(jié)構(gòu)。動粒主要是由多種著絲粒蛋白(centromeric proteins，CENPs)和串聯(lián)重復(fù)的衛(wèi)星DNA等組成，其內(nèi)層附著在著絲粒上，外層和紡錘絲微管相連，并在其牽引下完成染色體移動和分離等過程。動粒結(jié)構(gòu)或者組成的缺失或者變化，可能會導(dǎo)致紡錘絲微管的附著失敗或者不平衡，進(jìn)而引起染色體分離異常。有研究發(fā)現(xiàn)，在各種類型的腫瘤中染色體數(shù)目和形態(tài)異常是其顯著的遺傳學(xué)特征，而染色體不分離或錯誤分離是產(chǎn)生上述結(jié)果的直接原因。有研究發(fā)現(xiàn)，在HEP-2和SW626等細(xì)胞染色體上動粒變異的概率遠(yuǎn)高于正常細(xì)胞[1-2]，而在健康人外周血淋巴細(xì)胞動粒的變異則極為罕見[3]。上述發(fā)現(xiàn)提示動粒的畸變可能是引起腫瘤細(xì)胞染色體異常的原因之一。作者采用改良的動粒-核仁組織區(qū)(centromeric dots-nucleolus organizer region，Cd-NOR)銀染法[4-5]，分析了U937白血病細(xì)胞系的動粒變異情況，以期為急性髓系白血病的診斷提供新手段和后續(xù)研究的開展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 U937白血病細(xì)胞株(觀察組)保存于重慶消防總隊醫(yī)院檢驗科，健康人外周血(對照組)也收集于本科室，提前排除遺傳病和其他可能引起染色體變異的疾病，所有受試者勻簽知情同意書。RPMI1640、胎牛血清(FCS)購自美國Gibco公司，硝酸銀等常用試劑勻使用國產(chǎn)分析純。

1.2方法 U937細(xì)胞株使用90% RPMI1640+10% FCS混合培養(yǎng)基在37 ℃，5% CO2濃度，飽和濕度培養(yǎng)，待其生長分裂旺盛時，加入終濃度0.2 μg/mL的秋水仙素，于培養(yǎng)環(huán)境中孵育4 h后，0.2%胰蛋白酶消化收獲細(xì)胞。健康人外周血細(xì)胞使用90% RPMI1640+10% FCS混合培養(yǎng)基在37 ℃封閉培養(yǎng)72 h后加入0.2 μg/mL的秋水仙素，孵育2 h，1 000 r/min常溫離心10 min收獲細(xì)胞。常規(guī)染色體制備方法，滴片后于60 ℃烤箱中老化過夜，采用Cd -NOR同步銀染法染色，油鏡下觀察計數(shù)并照相。分別統(tǒng)計兩組細(xì)胞分裂相各300個，得到4種動粒變異類型的染色體數(shù)以及染色體總數(shù)。動粒變異分類參照相關(guān)文獻(xiàn)[1-2]，將動粒變異分為4類：動粒缺失、Cd-NOR融合、不對稱動粒及動粒遲滯復(fù)制。染色體動粒分類標(biāo)準(zhǔn)模式，見圖1。

a：動粒缺失；b： Cd-NOR融合；c：不對稱動粒；d：動粒遲滯復(fù)制；e：正常動粒。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。采用χ2分析，對兩組同一動粒變異類型進(jìn)行兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

本文一共分析了U937細(xì)胞株染色體分裂象300個，共計染色體15 728條：檢出動粒缺失(封2圖2：a)染色體126條(0.80%)、Cd-NOR融合(封2圖2：b)染色體112條(0.71%)、不對稱動粒(封2圖2：c)染色體38條(0.24%)、動粒遲滯復(fù)制(封2圖2：d)染色體59條(0.38%)、正常動粒(封2圖2：e)染色體15 393條(97.87%)；和對照組外周血淋巴細(xì)胞動粒變異數(shù)據(jù)相比較，動粒缺失、遲滯復(fù)制和不對稱的概率顯著升高(P<0.01)，Cd-NOR融合差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組細(xì)胞染色體動粒變異情況比較[n(%)]

3 討 論

染色體不穩(wěn)定(chromosomal instability,CIN)是腫瘤細(xì)胞最顯著的遺傳學(xué)特征之一[6-8]，但到底是細(xì)胞腫瘤化導(dǎo)致CIN，還是因為某些關(guān)鍵染色體的高度畸變而使細(xì)胞腫瘤化，二者之間的因果關(guān)系一直未能明確。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞染色體著絲粒上動粒蛋白缺失/失活概率遠(yuǎn)高于正常細(xì)胞[1-2]，提示動粒結(jié)構(gòu)的完整性對保持染色體穩(wěn)定至關(guān)重要。動粒結(jié)構(gòu)的缺失將會影響紡錘絲微管附著，分裂后期染色體不能在紡錘絲微管的牽引下正確向細(xì)胞兩極移動，進(jìn)而引起染色體不分離或者錯誤分離。

通過分析U937腫瘤細(xì)胞動粒并和健康人外周血淋巴細(xì)胞染色體對比發(fā)現(xiàn)，其變異主要分為3種類型：缺失(封2圖2：a)，不對稱(封2圖2：c)和遲滯復(fù)制(封2圖2：d)，而Cd-NOR融合(封2圖2：b)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本文結(jié)果顯示，U937細(xì)胞動粒缺失率(0.80%)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常細(xì)胞(0.25%)，提示動粒缺失可能是引起其染色體不穩(wěn)定的一個重要因素。有研究顯示被巨細(xì)胞病毒感染而導(dǎo)致流產(chǎn)的胚胎染色體動?；兟拭黠@增高，其中動粒消失和變小為其主要變異方式[9]。動粒上含有多種維持著絲粒功能、結(jié)構(gòu)的CENPs以及Mad(mitotic arrest defective)、Bub(budding uninhibited by benomyl)等促使微管和動粒接觸的重要蛋白[10-11]，是紡錘絲微管連接著絲粒的關(guān)鍵元件。如果一對姐妹染色單體上動粒出現(xiàn)缺失，由該側(cè)中心體發(fā)出的紡錘絲不能和染色單體連接，導(dǎo)致牽引不平衡，則必然會在分裂后期引起染色丟失或增加等現(xiàn)象[12]。

Cd-NOR同步銀染法，主要是針對其結(jié)構(gòu)上豐富的蛋白質(zhì)進(jìn)行著色，銀染下較大的動?？赡芎懈嗟腃ENPs等和其他與紡錘絲連接相關(guān)物質(zhì)，正常染色體之間動粒大小本不盡相同[13]，但姐妹染色單體上的動粒通常是大小一致的兩個對稱小點，這和分裂的有序性有很大關(guān)系。本研究中發(fā)現(xiàn)U937腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)較高頻率的不對稱動粒(0.24%)，動粒結(jié)構(gòu)的不對稱可能會影響到兩極中心體發(fā)散出紡錘絲的附著數(shù)量，破壞紡錘絲牽引姐妹染色單體的平衡性，這也可能是引起染色體分離出現(xiàn)問題的潛在因素之一。作者也觀察到U937腫瘤細(xì)胞染色體中存在動粒遲滯復(fù)制的現(xiàn)象(0.38%)，和正常細(xì)胞動粒遲滯率(0.14%)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在分裂間期染色體復(fù)制時，由于種種原因動粒并未復(fù)制或復(fù)制后未分離，致使分裂期的一對染色體上只有一個動粒，這種現(xiàn)象稱之為動粒遲滯復(fù)制。只有一個動粒結(jié)構(gòu)的染色體在有絲分裂中/后期時，細(xì)胞兩極中心體發(fā)出的紡錘絲都附著在同一個動粒上，不能使姐妹染色單體順利分離并移動到兩極，從而導(dǎo)致兩條染色單體進(jìn)入同一子細(xì)胞或者丟失在細(xì)胞質(zhì)中[14]。

腫瘤細(xì)胞染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)變異可能受多種因素影響，本文從和染色體分離直接相關(guān)的動粒入手，探討了動粒和腫瘤染色體變異之間可能的相互聯(lián)系。Cd-NOR同步銀染可以特異性的對著絲粒上有活性的動粒染色。和目前使用較多的間接免疫熒光方法相比，該方法不需要昂貴的ACA(Anti-Chromosome antibody)抗體，操作的時間短，有利于疾病的快速診斷。同時，銀染片無需封片，在常溫下也能保存數(shù)年時間，有利于患者資料的保存，避免了熒光易淬滅保存時間短的缺點。因此Cd-NOR同步銀染法可作為一種診斷腫瘤的快速臨床診斷方法。

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