王曉紅，邵 彬，黃禮群

(廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院康復(fù)理療科，武漢 430070)

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)可引起下尿路排尿功能障礙(神經(jīng)源性膀胱)，嚴(yán)重時(shí)可伴發(fā)致死性尿路感染或慢性腎衰竭[1]。臨床實(shí)踐已證實(shí)高壓氧是治療SCI的重要方法，但高壓氧治療神經(jīng)源性膀胱的機(jī)制尚不清楚，其可能的機(jī)制是高壓氧可以保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，促進(jìn)神經(jīng)纖維再生[2]，從而誘發(fā)或重建正常的排尿反射；電針可以通過(guò)多環(huán)節(jié)延緩和減輕SCI的程度，改善損傷后并發(fā)癥[3]，同時(shí)大量臨床實(shí)踐也證實(shí)電針在改善SCI后排尿功能方面具有獨(dú)特療效[4-5]，本文旨在觀察高壓氧結(jié)合電針治療對(duì)SCI后大鼠膀胱功能的影響，從而為臨床治療SCI后神經(jīng)源性膀胱提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為健康雌性SD大鼠60只(鼠齡 4～6周)，體質(zhì)量250～350 g，按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組：對(duì)照組、高壓氧組和高壓氧結(jié)合電針組(結(jié)合電針組)，每組20只；各組又按手術(shù)后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)分為24 h，3 d、7 d、14 d組，每組5只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供，飼養(yǎng)溫度為20～23 ℃，濕度為50%～60%，大鼠在籠內(nèi)自由進(jìn)食飲水。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制備 采用Allen′s 重物撞擊法制造大鼠SCI模型。稱(chēng)取大鼠體質(zhì)量后，給予10%水合氯醛溶液按4 mL/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，然后用電子剃毛器剃去大鼠背部毛發(fā)，以T12為中心顯露直徑約為0.5 cm的圓形無(wú)菌區(qū)，作為SCI區(qū)。將大鼠固定在鼠臺(tái)上，以T12棘突為中心背部正中縱行切口，長(zhǎng)約3 cm，顯露脊柱后，在T11～12間用血管鉗小心咬除棘突和雙側(cè)椎板，露出白色的脊髓后，用致傷量為50 g/cm2的Allen′s重物撞擊法損傷脊髓，大鼠的雙下肢出現(xiàn)回縮性撲動(dòng)、尾巴呈痙攣性擺動(dòng)后雙下肢癱瘓，表明造模成功，然后依層次縫合。術(shù)后給予青霉素腹腔注射預(yù)防感染。所有大鼠均接受Allen′s 重物撞擊法制造SCI模型，造模成功后12 h按不同組別給予相應(yīng)治療，其中對(duì)照組不接受任何治療，高壓氧組僅接受高壓氧治療，結(jié)合電針組接受高壓氧及電針治療。

1.2.2高壓氧治療 高壓氧組及結(jié)合電針組大鼠于術(shù)后12 h進(jìn)艙，先用純氧洗艙10 min ，使艙內(nèi)氧濃度大于95%，20 min內(nèi)緩慢加壓至0.25 MPa。在高壓下停留60 min，其間用純氧通風(fēng)10 min，停留結(jié)束后在20 min內(nèi)勻速減壓至常壓，結(jié)束治療。高壓氧治療每天1次。

1.2.3電針治療 結(jié)合電針組大鼠于高壓氧治療后開(kāi)始電針治療，電針治療參數(shù)：輸出電壓4～6 V，疏波4 Hz，密波20 Hz，留針20 min，每天1次。取穴及針刺方法[6]：大椎穴，背中線上，C7與T1棘突間，順棘突間直刺5 mm；腎俞穴，L2棘突下兩旁，直刺6 mm；三陰交穴，后肢內(nèi)踝尖直上10 mm，直刺5 mm。

1.2.4尿流動(dòng)力學(xué)檢查 大鼠稱(chēng)體質(zhì)量后，先以25%烏拉坦按1.0 g/kg腹腔注射麻醉[7]，30 min后經(jīng)尿道插入3號(hào)輸尿管導(dǎo)管，將大鼠放入測(cè)壓籠內(nèi)，設(shè)置室溫為30 ℃。輸尿管導(dǎo)管接上三通，用注射器抽出膀胱內(nèi)尿液后，三通一端與微量灌注泵相接，另一端接尿動(dòng)力儀的膀胱壓力傳感器，體內(nèi)置零。再以0.2 mL/min的速度向膀胱內(nèi)灌注室溫下生理鹽水，至大鼠開(kāi)始排尿時(shí)停止注水。測(cè)定排尿量，以1 mL注射器抽出膀胱內(nèi)殘余尿。連續(xù)測(cè)量3次。膀胱測(cè)量指標(biāo)為膀胱容量(灌注速度×灌注時(shí)間)、排尿量、殘余尿量(膀胱容量-排尿量)、排尿速率、最大排尿壓。

1.2.5取材 分別在造模后24 h,3、7、14 d處死大鼠。處死前大鼠完成尿流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)，檢測(cè)后開(kāi)胸暴露心臟，心臟灌注冰生理鹽水至流出液為清亮后給予4%的多聚甲醛溶液繼續(xù)灌注，灌注完成后取出受損脊髓節(jié)段頭端3 mm、尾端3 mm的脊髓組織，及大鼠膀胱標(biāo)本放入相同灌注液中，置入4 ℃冰箱過(guò)夜。乙醇脫水石蠟包埋并切片，其中脊髓切片為頭端5 μm，尾端5 μm各一張。

1.2.6神經(jīng)型一氧化氮合酶(Neuronal nitric oxide synthase，nNOS)表達(dá)檢測(cè) 根據(jù)GENE TECH 公司兩步法抗兔/鼠通用型免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，石蠟切片置于65 ℃烘箱中，烘片2 h，脫蠟至水，用PBS(pH 7.4)沖洗3次，每次5 min；高壓熱修復(fù)：在沸水中加入Na2EDTA(pH 9.0)。蓋上不銹鋼鍋蓋，但不能鎖定。將玻片置于金屬染色架上，緩慢加壓，使玻片在緩沖液中浸泡5 min，然后將蓋子鎖定，小閥門(mén)將會(huì)升起來(lái)。10 min后除去熱源，自然冷卻。切片放入3%過(guò)氧化氫溶液，室溫下孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。PBS(pH 7.4)沖洗3次，每次5 min；甩去PBS液，第一抗體1∶100濃度稀釋。每張切片加入50 μL稀釋液，4 ℃過(guò)夜；PBS沖洗3次，每次5 min；甩去PBS液，每張切片加50～100 μL A液(ChemMateTMEnVision+/HRP)，室溫下孵育45 min；PBS沖洗3次，每次3 min；甩去PBS液，每張切片加50～100 μL新鮮配制的DAB溶液，室溫下孵育5 min，顯微鏡控制顯色；顯色完全后，蒸餾水或自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染，0.1%鹽酸分化，自來(lái)水沖洗，PBS沖洗返藍(lán)；切片經(jīng)過(guò)梯度乙醇(70%～100%)脫水干燥，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固；用PBS代替一抗做陰性對(duì)照，高倍視野(×400)下計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率，即每張切片隨機(jī)取出10個(gè)不重疊高倍視野，算出陽(yáng)性細(xì)胞率。

2 結(jié) 果

2.1nNOS在脊髓及膀胱組織中的表達(dá) 在各時(shí)間點(diǎn)上，對(duì)照組、高壓氧組及結(jié)合電針組的脊髓及膀胱組織中均有表達(dá)(封2圖1)，陽(yáng)性細(xì)胞即為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)棕黃色染色顆粒；免疫組化結(jié)果顯示，在各時(shí)間點(diǎn)上，高壓氧組及結(jié)合電針組nNOS陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)均高于對(duì)照組(P<0.01)，結(jié)合電針組的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著高于高壓氧組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.2尿流動(dòng)力學(xué)分析 尿流動(dòng)力學(xué)結(jié)果顯示，對(duì)照組、高壓氧組及結(jié)合電針組尿流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)在術(shù)后24 h比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；術(shù)后3 d及以上，高壓氧組及結(jié)合電針組各項(xiàng)尿流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)均優(yōu)于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；術(shù)后7、14 d，結(jié)合電針組的尿流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)明顯優(yōu)于高壓氧組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表1 nNOS在脊髓及膀胱組織中陽(yáng)性細(xì)胞率的表達(dá)±s，%)

表2 各組尿流動(dòng)力學(xué)的影響±s)

續(xù)表2 各組尿流動(dòng)力學(xué)的影響±s)

3 討 論

由于控制膀胱的中樞或周?chē)窠?jīng)傷病所引起的排尿功能障礙，稱(chēng)為神經(jīng)源性膀胱，它是SCI的常見(jiàn)合并癥之一[8]。神經(jīng)源性膀胱引起嚴(yán)重尿潴留、尿路感染、膀胱內(nèi)高壓、膀胱-輸尿管反流，甚至發(fā)生慢性腎衰竭，是截癱患者的首位死亡原因。1987～1988年，中國(guó)康復(fù)研究中心對(duì)唐山地震后因SCI造成截癱死亡的374例患者進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)腎衰竭占死因的40%以上。

國(guó)內(nèi)外研究表明，氮能神經(jīng)遞質(zhì)合成減少在神經(jīng)源性膀胱發(fā)病過(guò)程中起重要作用。由于一氧化氮(nitric oxide,NO)的化學(xué)性質(zhì)極不穩(wěn)定，目前主要是通過(guò)檢測(cè)一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)及其降解產(chǎn)物的含量間接了解NO的變化。NOS陽(yáng)性神經(jīng)纖維廣泛分布于膀胱及尿道組織，NO通過(guò)NO-cGMP信號(hào)途徑舒張下尿路平滑肌，降低正常排尿時(shí)的尿道壓，對(duì)維持正常的膀胱儲(chǔ)、排尿功能有重要意義[9-11]。敲除nNOS基因的小鼠膀胱-尿道括約肌功能紊亂，有排尿困難、尿頻等癥狀[12]。神經(jīng)源性膀胱逼尿肌、膀胱頸平滑肌中氮能神經(jīng)遞質(zhì)含量明顯下降,從而使逼尿肌興奮性升高，膀胱收縮與舒張功能失調(diào)，導(dǎo)致排尿障礙[13]。國(guó)內(nèi)研究報(bào)道電針治療使SCI后大鼠膀胱逼尿肌及膀胱頸平滑肌中nNOS 表達(dá)增加，從而改善大鼠排尿功能[14-15]；高壓氧治療可以促進(jìn)損傷后脊髓的神經(jīng)細(xì)胞再生[16-17]，在本文的前期研究中，發(fā)現(xiàn)高壓氧能夠顯著減少SCI大鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的同時(shí)，還能改善SCI大鼠的肢體功能及行為學(xué)評(píng)分[18]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)上，高壓氧組及結(jié)合電針組nNOS陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)均高于對(duì)照組(P<0.01)，結(jié)合電針組的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著高于高壓氧組(P<0.05)；術(shù)后7、14 d，結(jié)合電針組的尿流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)明顯優(yōu)于高壓氧組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明高壓氧及電針治療都能改善SCI后大鼠尿流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，且都與脊髓及膀胱組織中氮能神經(jīng)遞質(zhì)的合成與釋放增加有關(guān)。所以本研究認(rèn)為高壓氧與電針相結(jié)合治療SCI后神經(jīng)源性膀胱，能夠更好地改善SCI后大鼠的膀胱功能。其機(jī)制可能是：(1)高壓氧能明顯增加損傷脊髓組織氧張力，調(diào)節(jié)微循環(huán)功能，減輕脊髓水腫，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，促進(jìn)神經(jīng)纖維再生，同時(shí)高壓氧也能提高脊髓對(duì)缺氧的耐受性[19]，使脊髓神經(jīng)元細(xì)胞缺血缺氧狀態(tài)得到改善，繼而使更多殘存的神經(jīng)細(xì)胞免于繼發(fā)性損傷，更多地保留支配膀胱的神經(jīng)功能。(2)中醫(yī)認(rèn)為SCI的病因病機(jī)是由于督脈受損，電針督脈(大椎穴)可以改善SCI局部組織的血液微循環(huán)，又能促進(jìn)腦脊液流動(dòng)，減輕SCI 部位的水腫和血腫的壓迫及粘連，從而扼制了脊髓繼發(fā)性損傷的進(jìn)行[20]；三陰交是足三陰經(jīng)交會(huì)穴，三陰經(jīng)循行少腹或陰器，能通調(diào)下焦之氣機(jī)，推測(cè)電針刺激通過(guò)反射弧到脊髓后根激發(fā)腰骶部排尿中樞，引起反射性排尿；腎俞穴內(nèi)有第1、2腰髓側(cè)角發(fā)出的交感神經(jīng)纖維，可使尿道內(nèi)括約肌收縮，而使膀胱容量增大，減少排尿次數(shù)。同時(shí)電針治療具有清除自由基和抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用，從而提高氧化能力，改善急性SCI，這也可能是電針改善SCI作用途徑之一[21]。(3)本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，高壓氧結(jié)合電針治療使nNOS表達(dá)顯著增加，使氮能神經(jīng)遞質(zhì)合成增加，并使膀胱和尿道組織中抑制性神經(jīng)遞質(zhì)水平升高，尿道及膀胱頸痙攣減輕，平滑肌舒張，尿道阻力降低，逼尿肌舒張，無(wú)抑制收縮頻率減少，膀胱順應(yīng)性提高，由此改善大鼠尿流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，排尿障礙癥狀改善。總之，高壓氧結(jié)合電針治療對(duì)SCI后大鼠的神經(jīng)元具有保護(hù)作用，并能很好改善大鼠的膀胱功能。

[1]候春林.脊髓損傷后膀胱功能重建[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2008，28(8)：663-665.

[2]Ishibara H，Kanamori M，Kawaguchi Y，et al.Prediction of neurologic outcome in patients with spinal cord injury by using hyperbaric oxygen therapy[J].J Orthop Sci，2001，6(5):385-389.

[3]劉瑩瑩，陳向華.電針治療脊髓損傷機(jī)制研究進(jìn)展[J].安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，30(3)：76.

[4]周凌云，李杰，李春梅，等.電針八髎、會(huì)陽(yáng)治療脊髓損傷性尿潴留療效觀察[J].中國(guó)針灸，2006，26(4)：237-239.

[5]吳東，曾立志，朱崇田，等.針灸配合膀胱功能訓(xùn)練治療脊髓損傷后尿潴留35例[J].上海針灸雜志，2006，25(10)：33.

[6]林文注，王珮.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1994：288-290.

[7]孫雙權(quán) ，陳忠，葉章群，等.兩種大鼠膀胱測(cè)壓方法的比較[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2008，18(7)：50-53.

[8]Xiao CG.Reinnervation for neurogenic bladder:historic review and introduction of a somatic-autonomic reflex pathway procedure for patients with spinal cord injury or spinal bifida[J].Eur Urol，2006，49(1):22-28.

[9]Gillespie JI，Markerink-Van Ittersum M，de Vente J.Endogenous nitric oxide/cGMP signalling in the guinea pig bladder:evidence for distinct populations of sub-urothelial interstitial cells[J].Cell Tissue Res，2006，325(2):325-332.

[10]Hedlund P.Nitric oxide/cGMP-mediated effects in the outflow region of the lower urinary tract--is there a basis for pharmacological targeting of cGMP?[J].World J Urol，2005，23(6)：362-367.

[11]Poladia DP，Bauer JA.Nitric oxide in the urinary bladder:involvement of auto-relaxation[J].Nitric Oxide，2004，10(1)：51-52.

[12]Burnett AL，Calvin DC，Chamness SL，et al.Urinary bladder-urethral sphincter dysfunction in mice with targeted disruption of neuronal nitric oxide synthase models idiopathic voiding disorders in humans[J].Nat Med，1997，3(5):571-574.

[13]Diniz P，Soejima K，Ito G.Nitric oxide mediates the effects of pulsed electromagnetic field stimulation on the osteoblast proliferation and differentiation[J].Nitric Oxide，2002，7(1)：18-23.

[14]陳躍來(lái)，岑玨，候文光，等.電針對(duì)大鼠不穩(wěn)定膀胱逼尿肌及膀胱頸氮能神經(jīng)遞質(zhì)的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2006，4(1)：73-75.

[15]黃昭明，李靜，鄭少斌.脊髓損傷后膀胱氮能神經(jīng)變化的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2001，26(10)：743-744.

[16]王鋼，劉世清.高壓氧對(duì)鼠損傷脊髓內(nèi)神經(jīng)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響[J].中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志，2004，26(12)：712-714.

[17]王鋼，劉世清，王石順.高壓氧對(duì)損傷脊髓GAP-43 mRNA表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華航海醫(yī)學(xué)與高氣壓醫(yī)學(xué)雜志，2004，11(4)：217-219.

[18]王曉紅，邵彬，王琴，等.高壓氧治療對(duì)脊髓損傷后大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡及行為學(xué)評(píng)分的影響[J].重慶醫(yī)學(xué)，2010，39(8)：935-936.

[19]Dong H，Xiong L，Zhu Z，et al.Preconditioning with hyperbaric oxygen and hyperoxi induces tolerance against spinal cord ischemia in rabbits[J].Anesthesiology，2002，96(40)：907-912.

[20]徐斌.脊髓針為主綜合治療法治療外傷性截癱286例療效觀察[J].中國(guó)針灸，1990，10(2)：7-9.

[21]宋琳，李曉寧，王瑩威，等.電針對(duì)急性脊髓損傷大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響[J].針灸臨床雜志，2011，27(1)：55-57.