田 曄 ,滕 應(yīng),趙 靜,李振高,馬文亭 ,張明旭 ,駱永明 ,3* (.安徽理工大學(xué)地球與環(huán)境學(xué)院,安徽 淮南 300；.中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所,土壤環(huán)境與污染修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 0008；3.中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所,山東 煙臺(tái) 64003)

銅(Cu)是生物體內(nèi)基本的微量營(yíng)養(yǎng)元素之一,但過(guò)量的Cu會(huì)對(duì)生物體產(chǎn)生毒性[1].植物修復(fù)是Cu污染土壤修復(fù)的重要手段之一[2-3].海州香薷(Elsholtzia splendens Nakai)是中國(guó)原生Cu耐性/富集植物,因其生物量較大且對(duì) Pb、Zn污染土壤亦有較強(qiáng)適應(yīng)性,成為目前Cu污染土壤修復(fù)的常用植物[4-5].但高Cu濃度引起的植物生長(zhǎng)緩慢,生物量小甚至死亡及土壤Cu有效性低等問(wèn)題限制了海州香薷對(duì)Cu的提取[6-7].目前微生物強(qiáng)化已是植物修復(fù)研究的熱點(diǎn)[8],微生物可通過(guò)促進(jìn)植物生長(zhǎng)和提高植物對(duì)重金屬吸收能力兩方面增強(qiáng)植物對(duì)土壤重金屬的積累量[8-9],達(dá)到強(qiáng)化重金屬污染土壤的植物修復(fù)的目的.目前,用于強(qiáng)化植物修復(fù)效應(yīng)研究的微生物主要為具重金屬抗性的細(xì)菌和真菌.細(xì)菌主要見于植物促生細(xì)菌(PGPR),真菌主要見于叢枝菌根真菌(AMF)[10].Cu污染土壤通常pH值偏酸性,而真菌比細(xì)菌更適應(yīng)酸性環(huán)境.但由于叢枝菌根真菌難分離純化及純培養(yǎng),一定程度上限制了其應(yīng)用.木霉屬(Trichoderma)真菌在土壤中分布廣泛、生物量大,環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng),在酸性土壤上生長(zhǎng)良好,且易于分離純化和培養(yǎng),目前主要在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中用于促進(jìn)植物生長(zhǎng)、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性等[11-12].另外,Anand等[13]、沈薇等[14]和胡亮等[15]研究表明,木霉在搖瓶條件下對(duì)重金屬Cu、Pb和Zn均有較強(qiáng)抗性.因此推斷木霉屬真菌具有強(qiáng)化Cu污染土壤的植物修復(fù)效應(yīng)的潛力.

里氏木霉 FS10-C(Trichoderma reesei FS10-C)是本課題組從Cu污染土壤中篩選出的1株抗Cu木霉,白色棉絮狀菌絲、綠色孢子、產(chǎn)黃色素,已送由中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏(保藏編號(hào):CGMCC NO.3970).目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于木霉與植物生長(zhǎng)及木霉與重金屬關(guān)系的研究常見于哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、綠色木霉(Trichoderma virens)和深綠木霉(Trichoderma atroviride)[16-18],尚未見關(guān)于里氏木霉對(duì)海州香薷生長(zhǎng)和重金屬吸收影響的相關(guān)研究.本課題組前期研究證實(shí),該株木霉具ACC脫氨酶、解磷作用和產(chǎn)鐵載體等促生活性;且搖瓶條件下,在pH值2～10,Cu濃度≤600mg/kg時(shí)均可生長(zhǎng)發(fā)育,100mg/kg和200mg/kg濃度下Cu積累率分別可達(dá)50.6%和30.3%;另外,課題組前期對(duì)該株木霉的生物安全性評(píng)價(jià)研究亦表明該菌及其代謝產(chǎn)物均對(duì)人畜無(wú)害.由此推測(cè)里氏木霉FS10-C可作為一株強(qiáng)化Cu污染土壤植物修復(fù)作用的候選菌.

為便于保存和施用,擬將該株木霉制備成固體生物制劑.許傳坤等[19]的研究表明,向土壤中添加額外能源物質(zhì)及其他有機(jī)物質(zhì)能降低或全部解除土壤對(duì)木霉的抑制作用.據(jù)此,經(jīng)前期固體基質(zhì)的物料篩選,本研究選擇苜蓿粉作為固體基質(zhì)制備木霉制劑并采用溫室盆栽試驗(yàn),探討施加木霉制劑對(duì)外源Cu土壤上海州香薷生長(zhǎng)及Cu吸收能力的影響.以期為海州香薷修復(fù)Cu污染土壤提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

供試土壤為南京棲霞山無(wú)污染的黃棕壤,風(fēng)干研磨過(guò)2mm篩.土壤pH值6.6,有機(jī)質(zhì)含量21.3g/kg,堿解氮含量162.3mg/kg,速效磷含量11.7mg/kg,速效鉀含量 82.2mg/kg,陽(yáng)離子交換量16.5cmol/kg, Cu全量30.0mg/kg, Zn全量77.4mg/kg, Pb全量87.4mg/kg,Cd未檢出.

海州香薷種子采自銅陵鐵頭山銅礦區(qū).

Cu污染土壤的制備:外源添加不同濃度CuSO4·5H2O,拌入基肥(尿素、磷酸氫二鈉和氯化鉀按N:0.15g/kg, P:0.10g/kg土,K:0.30g/kg施入).調(diào)節(jié)土壤水分至田間持水量的60%,老化15d后制備成0, 100, 200, 400mg/kg外源Cu濃度土壤.

表1 木霉制劑發(fā)酵條件正交試驗(yàn)的因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for optimizing fermentation conditions of Trichoderma sp.preparation

木霉制劑的制備:木霉制劑由本實(shí)驗(yàn)室篩選保存的抗銅里氏木霉FS10-C的孢子懸液經(jīng)滅菌苜蓿粉固體發(fā)酵制成.發(fā)酵條件經(jīng)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化篩選.篩選方案是:選取物料量(A)、固水比(B)和孢子接種量(C)3個(gè)因素,每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平,按照制劑孢子濃度篩選最佳發(fā)酵條件.各因素與水平設(shè)置見表1.發(fā)酵過(guò)程為:把苜蓿粉按一定固水比加入去離子水(表1),調(diào)勻后裝入直徑15cm玻璃培養(yǎng)皿中,滅菌制成滅菌基質(zhì).無(wú)菌條件下,接種定量的孢子懸液(106cfu/mL)于滅菌基質(zhì)中(表1),28℃恒溫培養(yǎng),第3d起每天攪動(dòng)1次,7d后混勻待用.木霉制劑采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)孢子濃度(cfu/g),4℃保存待用.

1.2 盆栽試驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施

每盆2.5kg土.每個(gè)土壤外源Cu水平均設(shè)3個(gè)處理:空白(只種海州香薷)、滅菌基質(zhì) (種海州香薷+施加滅菌苜蓿粉)、木霉制劑(種海州香薷+施加木霉制劑),每個(gè)處理 3個(gè)重復(fù).按土壤質(zhì)量的4%將木霉制劑拌入土壤中,表層覆土平衡 3d后播種.海州香薷的種子用75%的乙醇消毒,無(wú)菌水沖洗.采用培養(yǎng)皿法發(fā)芽,待種子露白萌發(fā)后播入盆中,每盆播 15粒.播種后每天補(bǔ)充去離子水達(dá)田間持水量的60%,待苗齊、苗壯后定苗.盆栽試驗(yàn)在溫室進(jìn)行,6月19日播種,10月20日收獲.

1.3 盆栽試驗(yàn)測(cè)定指標(biāo)和方法

海州香薷收獲前測(cè)株高,分地上部和根分別收獲.植物樣用自來(lái)水和去離子水沖洗后擦干,105℃下殺青 30min,80℃烘干至恒重后,分別測(cè)量植物地上部和根干重(g).將地上部和根分別用不銹鋼粉碎機(jī)粉碎,HNO3-HClO4(3:2,V/V)消解后測(cè)Cu濃度.土樣風(fēng)干過(guò)20目篩,與 1mol/L NH4OAc(pH值7)混合(土液比1:5),180r/min震蕩16h,3600r/min離心5min,上清液過(guò)濾測(cè)土壤有效態(tài)Cu含量.Cu含量采用火焰原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定.

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用EXCEL2003和SPSS 12.0進(jìn)行圖表制作和方差分析等數(shù)據(jù)處理.

2 結(jié)果與分析

2.1 木霉制劑制備的最佳條件

正交試驗(yàn)結(jié)果顯示,木霉制劑發(fā)酵的最佳條件為A1B3C2,即物料量 20g、固水比為1:1和孢子接種量為6%時(shí)發(fā)酵效果最佳.木霉制劑為綠色,孢子含量大于109cfu/g.

木霉對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求不嚴(yán)格,可分解利用纖維素、半纖維素、幾丁質(zhì)等為碳源[12].苜蓿含豐富的碳水化合物、多種礦物元素及維生素[20],具備木霉增殖所需的營(yíng)養(yǎng)條件.本研究結(jié)果證實(shí),以滅菌苜蓿粉為基質(zhì),不同于一般的泥炭等基質(zhì)僅機(jī)械地將微生物吸附于基質(zhì)上,而是以苜蓿粉為營(yíng)養(yǎng)來(lái)源和繁殖場(chǎng)所進(jìn)行木霉增殖,可通過(guò)顏色深淺初步判斷木霉制劑孢子含量,施用方法可參照一般固體菌肥.因此該里氏木霉制劑具有制備方法簡(jiǎn)單、孢子密度大且易施用等應(yīng)用優(yōu)點(diǎn).

2.2 木霉制劑對(duì)海州香薷生長(zhǎng)的影響

表2 木霉制劑對(duì)海州香薷生物量的影響Table2 Effect of Trichoderma.sp preparation on biomass of Elsholtzia splendens

施加木霉制劑后,除400mg/kg外源Cu土壤上地上部干重外,各Cu處理下,香薷生物量均呈增加趨勢(shì)(表2).其中與空白組相比,未加Cu時(shí)株高、地上部干重和根干重分別增加7.0%、59.8%和44.2%(P＜0.05), 100mg/kg外源Cu土壤上株高和根干重分別增加20.0%和108.5%(P＜0.05),200mg/kg外源Cu土壤上株高和地上部分別增加7.1%和35.9%(P＜0.05).

結(jié)果表明該木霉制劑在無(wú)污染和低Cu污染土壤上下可促進(jìn)海州香薷莖葉和根系發(fā)育,具有促進(jìn)海州香薷生長(zhǎng)的作用且主要是里氏木霉FS10-C作用的結(jié)果.Hoyos-Carvajal等[21]和Contreras-Cornejo等[22]的研究表明,木霉屬真菌具解磷能力,可產(chǎn)鐵載體、吲哚乙酸(IAA)和赤霉素等促生物質(zhì).Rudresh等[23]發(fā)現(xiàn)木霉菌可在液體培養(yǎng)條件下溶解難溶性磷酸鹽,提高植物對(duì)磷元素的利用,改善土壤的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境,促進(jìn)植物生長(zhǎng).本課題組前期研究證實(shí)里氏木霉 FS10-C具ACC脫氨酶、解磷和產(chǎn)鐵載體等促生活性,而本研究顯示出的里氏木霉FS10-C對(duì)海州香薷生長(zhǎng)的促進(jìn)可能與該株木霉的這些促生活性有關(guān).

400 mg/kg外源Cu土壤上,木霉制劑組根干重和株高增加不顯著,且地上部生物量反而低于空白對(duì)照,可能與此時(shí)木霉制劑極顯著提高了海州香薷的Cu積累量,在一定程度抑制了海州香薷的生長(zhǎng)和根際土著微生物有作用,使海州香薷生物量未見顯著增加.

而滅菌基質(zhì)組海州香薷僅在不加Cu和100mg/kg外源Cu土壤上生物量有高于空白組的趨勢(shì),且除 400mg/kg 外源Cu土壤上地上部干重顯著高于木霉制劑組外(P＜0.05),其余生物量指標(biāo)均呈小于木霉制劑組的趨勢(shì).這是由于滅菌基質(zhì)由苜蓿粉制成,施加苜蓿粉相當(dāng)施加有機(jī)物料.在無(wú)外源Cu和低外源Cu水平(≤100mg/kg)土壤中,苜蓿粉分解釋放有機(jī)質(zhì)可加強(qiáng)海州香薷根際的土著土壤微生物、土壤酶及土壤激素等促進(jìn)植物生長(zhǎng)的活性.但隨著Cu濃度升高,土壤中土著微生物數(shù)量減少或死亡且伴隨土壤酶和土壤激素等逐漸失活,失去其促進(jìn)植物生長(zhǎng)的活性.

2.3 木霉制劑對(duì)Cu污染土壤有效態(tài)Cu的影響

施加木霉制劑,各濃度外源Cu土壤NH4OAc提取態(tài)Cu含量分別增加42.9%、48.0%和27.5%(圖1),均顯著高于空白組(P＜0.05).而滅菌基質(zhì)組土壤Cu有效性均顯著降低(P＜0.05).

結(jié)果表明,木霉制劑可提高土壤Cu有效性,發(fā)揮土壤Cu活化作用.而滅菌基質(zhì)組土壤Cu有效性的降低則提示滅菌基質(zhì)在一定程度上起到鈍化土壤Cu的作用.這可能是滅菌苜蓿粉作為有機(jī)物料,可降低土壤外源Cu的有效性,其結(jié)果與王果等[24]、陳建斌等[25]和陸曉輝等[26]加入稻草、紫云英、玉米秸稈等土壤Cu的重金屬有效性降低的研究結(jié)果一致.由此也可推斷該木霉制劑對(duì)土壤Cu的活化作用是由里氏木霉FS10-C及其代謝產(chǎn)物的作用產(chǎn)生.

圖1 木霉制劑對(duì)Cu污染土壤Cu有效性的影響Fig.1 Effect of Trichoderma.sp preparation on Cu phytoavailability of Cu contaminated soil

文獻(xiàn)報(bào)道木霉代謝過(guò)程可產(chǎn)生如檸檬酸等有機(jī)酸代謝產(chǎn)物[13,27].本課題組對(duì)里氏木霉FS10-C的前期研究發(fā)現(xiàn),該株木霉在液體培養(yǎng)過(guò)程中降低了培養(yǎng)基pH值,可能是該株木霉在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的酸性代謝產(chǎn)物導(dǎo)致.據(jù)此推測(cè)木霉FS10-C對(duì)土壤Cu的活化作用可能是與木霉FS10-C代謝過(guò)程產(chǎn)生的鐵載體和有機(jī)酸等生物源螯合劑與土壤Cu發(fā)生螯合作用的結(jié)果[28],其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究.

2.4 木霉制劑對(duì)海州香薷Cu含量的影響

如圖2所示,施加木霉制劑后,海州香薷地上部Cu含量在200,400mg/kg外源Cu土壤上均呈增加趨勢(shì),且在400mg/kg外源Cu土壤上高于空白組112.0%(P＜0.05);根Cu含量在100,400mg/kg外源Cu土壤上分別顯著高于空白組22.4%和13.3%(P＜0.05).

而滅菌制劑組,海州香薷根Cu含量在各添加各外源Cu濃度土壤上均呈降低趨勢(shì);地上部Cu含量?jī)H在200mg/kg外源Cu土壤上時(shí)增加,但差異不顯著(P＞0.05).

圖2 木霉制劑對(duì)Cu污染土壤上海州香薷Cu含量影響Fig.2 Effect of Trichoderma sp. preparation on Cu concentration of Elsholtzia splendens

2.5 木霉制劑對(duì)海州香薷Cu積累量的影響

施加木霉制劑后,在各外源Cu濃度土壤上單株海州香薷Cu積累總量均呈增加趨勢(shì)(圖3).且在0,100, 400mg/kg外源Cu土壤上分別比空白組顯著增加 32.9%、75.3%和19.9%(P＜0.05).其中,根Cu積累量在0, 100, 400mg/kg土壤上分別增加16.9%、155%和16.0%(P＜0.05);地上部Cu積累量在 0,200,400mg/kg外源Cu土壤上分別增加44.7%、114.3%和32.5%(P＜0.05),而在 100mg/kg外源Cu土壤上下降16.1%,但差異并不顯著.

100mg/kg外源Cu土壤上,木霉制劑組海州香薷地上部Cu積累量雖略有下降的原因,推測(cè)與此時(shí)木霉在土壤中活性較高相關(guān).一方面,木霉制劑通過(guò)提高海州香薷生物量和土壤Cu有效性極顯著提高了根Cu積累量;另一方面,由于木霉對(duì)Cu的吸附作用對(duì)海州香薷根部的Cu產(chǎn)生固持作用,因此限制了根Cu向地上部的轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致地上部Cu積累量略有下降,這其實(shí)也是該株木霉增強(qiáng)海州香薷Cu抗逆性的體現(xiàn)之一.

圖3 木霉制劑對(duì)Cu污染土壤上海州香薷Cu含量影響Fig.3 Effect of Trichoderma sp. preparation on Cu accumulation of Elsholtzia splendens

滅菌制劑組,單株總Cu積累量和根Cu積累量?jī)H在100mg/kg外源Cu土壤上增加,而在200,400mg/kg外源Cu土壤上均顯著降低(P＜0.05).且除100mg/kg外源Cu土壤上地上部外,所有Cu積累量指標(biāo)均低于木霉制劑組.可見木霉制劑對(duì)海州香薷Cu積累作用主要是里氏木霉FS10-C及其代謝產(chǎn)物的作用.

3 結(jié)論

3.1 施加木霉制劑可在無(wú)污染,100和200mg/kg外源Cu土壤上提高海州香薷株高以及地上部和根的生物量,促進(jìn)海州香薷生長(zhǎng).

3.2 木霉制劑具有活化土壤Cu作用,在100和400mg/kg外源Cu土壤上可不同程度提高海州香薷整株、地上部和根的Cu積累量(除100mg/kg外源Cu土壤上,地上部Cu積累量略有降低外).

3.3 里氏木霉 FS10-C制劑可通過(guò)促進(jìn)海州香薷生長(zhǎng)和提高土壤Cu的植物有效性增強(qiáng)海州香薷Cu吸收能力,強(qiáng)化海州香薷對(duì)Cu污染土壤的修復(fù)效應(yīng),是一種頗具研究潛力的生物修復(fù)劑.

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