肖鵬程,朱端衛(wèi),羅 媛,萬小瓊,蔡建波 (華中農(nóng)業(yè)大學植物營養(yǎng)與生態(tài)環(huán)境研究室,湖北 武漢 430070)

環(huán)境因素對菹草根和葉細胞質膜Ca2+-ATPase活性的影響

肖鵬程,朱端衛(wèi)*,羅 媛,萬小瓊,蔡建波 (華中農(nóng)業(yè)大學植物營養(yǎng)與生態(tài)環(huán)境研究室,湖北 武漢 430070)

通過改變溶液溫度、pH值、ATP濃度、鈣濃度和培養(yǎng)液的鈣濃度等條件,研究了菹草根和葉細胞質膜Ca2+-ATPase的活性的變化.結果表明,根細胞質膜Ca2+-ATPase的活性在pH 6.0時最高,其最適反應溫度為40℃;葉細胞質膜Ca2+-ATPase在一個較寬的pH范圍內具有高活性,最適反應溫度為45℃;溶液中ATP濃度分別為3mmol/L和4mmol/L時菹草根和葉細胞質膜Ca2+-ATPase活性最大;無論是菹草根還是葉細胞質膜 Ca2+-ATPase活性,在溶液鈣濃度為 10-4mol/L時都最高.在營養(yǎng)液中添加不同 CaCl2濃度培養(yǎng)菹草,其根和葉細胞質膜Ca2+-ATPase活性表現(xiàn)出差異,根細胞質膜Ca2+-ATPase活性比葉細胞質膜Ca2+-ATPase活性高,且隨營養(yǎng)液中鈣濃度的增加,這種差異加大;當營養(yǎng)液中鈣濃度在10mg/L(2.5×10-4mol/L)以下時,Ca2+-ATPase活性逐漸上升,營養(yǎng)液中鈣濃度由10mg/L增加到15mg/L,Ca2+-ATPase活性陡然下降,這與溶液鈣濃度對Ca2+-ATPase活性的影響相呼應.

菹草；根;葉；細胞質膜；Ca2+-ATPase

鈣作為植物細胞的第二信使,在細胞質內的濃度變化可以調節(jié)許多生理生化過程,在植物體的生長發(fā)育以及對環(huán)境的反應和適應過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用[1].激素、環(huán)境因子等信號刺激導致植物細胞胞質內 Ca2+濃度大幅度增加,位于質膜和液泡膜上的 Ca2+轉運系統(tǒng)就會被激活,該系統(tǒng)將 Ca2+主動運到胞外和運進胞液,以維持細胞中 Ca2+濃度的正常水平[2].這種精細的 Ca2+轉運系統(tǒng)由Ca2+-ATPase,Ca2+/nH+反向轉運蛋白等組成[3-4].Ca2+-ATPase是一個高親和、低容量的鈣運輸系統(tǒng),其對胞內Ca2+平衡起微調作用[5].

另一方面,鈣是水中重要的營養(yǎng)元素,水生植物對其吸收與釋放是湖泊生態(tài)系統(tǒng)中地球化學的重要特征[6].湖泊中可溶性磷酸鹽在鈣參與下與碳酸鈣發(fā)生共沉淀,水柱中葉綠素 a因此而減少,藻類生長得到抑制[7].沉水植物對鈣的吸收與釋放將可能與水柱中碳酸鈣-磷共沉淀相聯(lián)系,但沉水植物中鈣的變化所遵循的生理生化機制及其涉及的過程目前仍缺乏論證.本研究室前期對鈣在菹草-溶液間的遷移速率研究中發(fā)現(xiàn),根室溶液中 Ca2+濃度為 10mg/L時,菹草對鈣的吸收效果最好;Ca2+濃度過高,菹草根系鈣吸收速率下降.雖然根室 Ca2+濃度為 10mg/L處理的菹草根系對 Ca2+的吸收量明顯小于 15mg/L的處理,但在后者中菹草莖葉分泌的鈣量反而小于在前者中的情況.這一鈣的吸收和釋放過程將可能與菹草細胞質膜 Ca2+-ATPase活性變化有關,本文將從這一假設出發(fā),探討菹草根和葉細胞質膜Ca2+-ATPase活性受外源的影響,以闡明菹草吸收、釋放鈣的機制.

1 材料與方法

1.1 材料與處理

供試菹草(Potamogeton crispus L.)石芽采自中國科學院武漢植物園,取回清洗干凈后將其用自來水培養(yǎng)馴化7d,選取大小和重量一致并已經(jīng)萌發(fā)的石芽培養(yǎng)于 0.01×Hoagland營養(yǎng)液里,營養(yǎng)液pH值每天用0.1mol/L HCl或者0.1mol/L NaOH調節(jié)到6.5左右,每3d換1次營養(yǎng)液.植物在溫室自然光條件下培養(yǎng),溫度為20～25℃.

1.2 細胞質膜微囊的提取

菹草的離體根、葉細胞質膜微囊的提取參照Thomson等[8]的方法稍作改動:取0.5g菹草根(或2.0g菹草葉片),按1:2(W:V)加入預冷勻漿液[蔗糖250mmol/L,Hepes-Tris (pH 值 7.5)25mmol/L, EDTA 5mmol/L,10%(W/V)甘油,1%(W/V)聚乙烯吡咯烷酮(30K),0.5%(W/V)牛血清蛋白(BSA), DTT 2mmol/L,Vc 5mmol/L]研磨成勻漿.勻漿液在9000×g、4℃下冷凍離心 15min,去除細胞核與葉綠體.將上清液于25000×g、4℃下冷凍離心60min,沉淀為膜制劑,再用少量懸浮液 [蔗糖250mmol/L, KH2PO4-K2HPO4緩 沖 液 (pH7.8) 5mmol/L, 10%(W/V)甘油]懸浮,此為粗膜提取物.提取物置于兩相系統(tǒng)[6.2%(W/W) PEG6000, 6.2% (W/W), Dextran500,蔗糖 250mmol/L, KH2PO4- K2HPO4緩沖液(pH 7.8)]中在2000 r/min、6mm振幅下振動5s后,在1000r/min、4℃條件下冷凍離心5min,促進分相.取上相,向所得含質膜微囊上相中,再加入0.5mL下相,在2000r/min、6mm振幅下振動5s后,以1000r/min、4℃冷凍離心5min促進分相,取上相.向經(jīng)過前述兩次萃取提純的含質膜微囊上相中加入懸浮液,在2000r/min、6mm振幅下振動5s后,以25000×g、4℃離心60min.加入懸浮液稀釋,得到純化的質膜微囊制劑.樣品用液氮速凍后于-80℃下保存待測.

1.3 質膜微囊Ca2+-ATPase活性的測定

提取所得細胞質膜微囊在一定條件下測定Ca2+-ATPase活性:(1)在 ATP濃度為 1.0×10-3mol/L,溫度為37℃下設置pH值梯度:5.0,6.0,7.0, 8.0,9.0;(2)在 ATP濃度為 1.0×10-3mol/L和最適pH 值下設置溫度梯度:35℃ ,40 ℃, 45℃ , 50 ℃, 55℃;(3)在最適溫度及最適pH值條件下,設置底物ATP濃度(mol/L)梯度:2.0×10-3,3.0×10-3, 4.0× 10-3,5.0×10-3;(4)在最適溫度、最適pH值條件及根細胞 ATP 3.0×10-3mol/L或葉細胞 ATP為4.0×10-3mol/L,設置 Ca2+濃度(mol/L)梯度:1.0× 10-3,1.0×10-4,1.0×10-5,1.0×10-6,1.0×10-7.

質膜微囊 Ca2+-ATPase活性的測定參照Chung等[9]的方法,略加改動.反應體系含1mmol/L NaN3, 50mmol/L NaNO3, 50mmol/L KCl, 8mmol/L MgSO4, 1mmol/L EGTA, 80μmol/L的Na2MoO4, 25mmol/L Hepes-Tris.以加與不加3 mmol/L CaCl2引起的酶活之差為Ca2+-ATPase活性,反應啟動用0.2mL 15mmol/L的Na2-ATP,用20%(W/V)三氯乙酸(TCA)終止反應,分別按鉬藍法和考馬斯亮藍法測定無機磷和蛋白質含量,用單位時間、單位質量蛋白質的無機磷量表示Ca2+-ATPase活性[μmolPi/(mgPro·min)].

1.4 環(huán)境鈣濃度對菹草細胞質膜 Ca2+-ATPase活性的影響

將在營養(yǎng)液中培養(yǎng) 30d后的菹草幼苗轉移至盛有不同Ca2+濃度的Hoagland完全營養(yǎng)液的隔室中進行培養(yǎng)(圖 1),其中,用莖葉室和根室(遮光)將菹草的莖、根分開,葉室和根室之間的菹草莖用濕棉球包裹,防止這部分莖失水而影響實驗,各室營養(yǎng)液體積V0均為1L[10].根室鈣濃度Co依次為0,5,10,15mg/L,重復3次;莖葉用去離子水培養(yǎng).分別于40,80,240,480min取完整植株,先后進行根和葉細胞質膜 Ca2+-ATPase的提取和該酶在最適條件下的活性測定.

圖1 測定菹草不同部位鈣吸收/分泌的二隔室實驗裝置Fig.1 Two-container setup for investigating uptake and exudation of calcium in different parts of P. crispus

2 結果與分析

2.1 溶液條件對菹草根和葉細胞質膜 Ca2+-ATPase活性的影響

2.1.1 溶液溫度 由圖2可見,菹草根、葉細胞質膜Ca2+-ATPase的最適反應溫度分別為40℃、45℃.就最適反應溫度來說,菹草葉細胞質膜Ca2+-ATPase最大活性所處溫度高于根細胞質膜Ca2+-ATPase最大活性所對應的溫度.圖2還表明,根細胞質膜 Ca2+-ATPase活性隨溫度變化的趨勢較快,而葉細胞質膜 Ca2+-ATPase活性變化稍平緩.在進一步研究菹草根、葉細胞質膜Ca2+-ATPase在其他條件下的活性時,將根、葉細胞質膜反應的溫度分別控制為40℃和45℃.

2.1.2 溶液pH值 圖3表明,菹草根細胞質膜和葉細胞質膜中Ca2+-ATPase活性都隨溶液pH值的變化而變化,且二者差異明顯,前者的Ca2+-ATPase活性在pH值6.0時最高,后者的最適pH值為7.0.在最適pH值下,菹草根細胞質膜Ca2+-ATPase活性是葉細胞質膜活性的 3.76倍.此外,葉細胞質膜Ca2+-ATPase在一個較寬的pH值范圍內相對活性較高.根據(jù) pH值對菹草根和葉細胞質膜 Ca2+-ATPase活性的影響,在研究底物ATP濃度和Ca2+濃度對酶活影響時,根、葉細胞質膜提取物的pH值分別控制在6.0和7.0.

圖2 溫度對菹草根和葉細胞質膜Ca2+-ATPase活性的影響Fig.2 Effect of temperature on the activities of plasma membrane Ca2+-ATPase from P. crispus root and leaf

圖3 pH值對菹草根和葉細胞質膜Ca2+-ATPase活性的影響Fig.3 Effect of pH on the activities of plasma membrane Ca2+-ATPase from P. crispus root and leaf

2.1.3 溶液 ATP濃度 菹草根和葉細胞質膜Ca2+-ATPase活性與底物ATP濃度密切相關(圖4).由圖4可知,在低濃度范圍內,酶活性均隨著ATP濃度的增加而迅速上升,當ATP濃度達到2mmol/L后,酶活性升高速度顯著降低,曲線趨于平緩.對根細胞質膜Ca2+-ATPase而言,3mmol/L ATP可使酶活性達到最大;而對于葉細胞質膜 Ca2+-ATPase, 4mmol/L ATP才能使酶活性達到最大.

圖4 ATP濃度對菹草根和葉細胞質膜Ca2+-ATPase活性的影響Fig.4 Effect of ATP concentration on the activities of plasma membrane Ca2+-ATPase from P. crispus root and leaf

圖5 Ca2+濃度對菹草根和葉細胞質膜Ca2+-ATPase活性的影響Fig.5 Effect of calcium concentration on the activities of plasma membrane Ca2+-ATPase from P. crispus root and leaf

2.1.4 溶液Ca2+濃度 由圖5可見,在低鈣濃度范圍內,Ca2+-ATPase活性隨Ca2+濃度的負對數(shù)的減小而升高, 1.0×10-4mol/L Ca2+可使酶達到最大激活,Ca2+濃度進一步增加反而抑制了 Ca2+-ATPase活性,使酶活性有所下降,菹草根和葉細胞質膜Ca2+-ATPase對Ca2+濃度的響應模式相同.

2.2 環(huán)境中鈣濃度對菹草根細胞質膜 Ca2+-ATPase活性的影響

表1所示的是經(jīng)不同 Ca2+濃度營養(yǎng)液培養(yǎng)的菹草根細胞質膜 Ca2+-ATPase活性的差異,且培養(yǎng)時間不同根細胞質膜 Ca2+-ATPase活性也不一樣.從同一時間的酶活來看,當營養(yǎng)液中Ca2+濃度為10mg/L時,菹草根細胞質膜Ca2+-ATPase活性最高;在 1～10mg/LCa2+范圍內,Ca2+-ATPase活性隨培養(yǎng)時間的延長而增加,從能量代謝的角度說明,菹草在這一濃度范圍內生長正常,而在相同條件下,15mg/LCa2+濃度由 240min時的0.535μmolPi/(mgPro·min)下降到 480min時的0.182μmolPi/(mgPro·min).進一步比較可以看出,在相同時間內,10mg/LCa2+的處理時,根中 Ca2+-ATPase活性最高,這一處理與其他處理相比,基本上都達到顯著性差異,而不加Ca2+的處理,根中Ca2+-ATPase活性都顯著低于其他加Ca2+處理.

表1 Ca2+濃度對菹草根細胞質膜Ca2+-ATPase活性影響[μmolPi/(mgPro·min)]Table 1 Effect of calcium concentration on the activities of plasma membrane Ca2+-ATPase from P. crispus root [μmolPi/(mgPro·min)]

2.3 環(huán)境中鈣濃度對菹草葉細胞質膜 Ca2+-ATPase活性的影響

由表2可知,在營養(yǎng)液中加5mg/L和10mg/L Ca2+,培養(yǎng)的菹草葉細胞質膜Ca2+-ATPase活性顯著高于不加鈣處理,說明營養(yǎng)液中添加CaCl2相應提高了葉細胞質膜 Ca2+-ATPase活性;隨著 Ca2+濃度進一步升高,葉細胞質膜Ca2+-ATPase活性反而下降,加 15mg/LCa2+培養(yǎng)的菹草葉細胞質膜Ca2+-ATPase活性在葉中顯著低于加 5mg/L和10mg/L Ca2+培養(yǎng)的處理.從培養(yǎng)時間對菹草葉細胞質膜 Ca2+-ATPase活性的影響來看,0～10mg/ LCa2+培養(yǎng)的菹草隨著時間的延長其葉細胞質膜Ca2+-ATPase活性在實驗時間范圍內逐漸加強,這一趨勢與對應處理的根細胞質膜Ca2+-ATPase活性的變化一致,而 15mg/LCa2+培養(yǎng)的菹草葉細胞質膜Ca2+-ATPase活性變化不平穩(wěn).

表2 Ca2+濃度對菹草葉細胞質膜Ca2+-ATPase活性影響 [μmolPi/(mgPro·min)]Table 2 Effect of calcium concentration on the activities of plasma membrane Ca2+-ATPase from P. crispus leaf [μmolPi/(mgPro·min)]

3 討論

酶促反應受多種因素影響,溫度是最重要的影響因素之一.本研究中菹草根、葉細胞質膜Ca2+-ATPase活性分別在溫度為40℃、45℃時達到最高.就最適溫度而言,菹草葉細胞質膜Ca2+-ATPase高于根細胞質膜Ca2+-ATPase,這與前人在陸生植物上的研究結果相類似[2,11].菹草根細胞質膜 Ca2+-ATPase活性隨溫度變化的趨勢較快,而葉細胞質膜 Ca2+-ATPase活性變化稍平緩.菹草的根生長在底質中,沉積物溫度變化較小,通常在莖葉進行光合作用的白天表層水溫度高于底層,菹草能在這種溫差條件下生長[12],可能與葉細胞質膜 Ca2+-ATPase反應的最適溫度較高有關.因此,菹草根和葉細胞質膜 Ca2+-ATPase最適反應溫度的差異可能是在長期進化過程中形成的.盡管離體酶活反應的最適溫度不一定能表征植株體內 Ca2+-ATPase的準確值,但卻能說明酶的一種體外特征.另一方面,菹草根和葉細胞質膜 Ca2+-ATPase最適反應溫度的差異也可能反映了Ca2+在相應部位遷移的能量差異.

菹草根和葉細胞質膜 Ca2+-ATPase活性最適 pH值分別為 6.0和 7.0,葉細胞質膜 Ca2+-ATPase在一個較寬的 pH值范圍內具有較高活性.菹草生長在低電導、高pH值的環(huán)境中[13],許多研究觀察到菹草生長的水體具有高 pH值性質

[14-16].通常認為,菹草生長過程中對CO2的吸收是菹草生長導致水體高 pH值的原因.由此可見,菹草根和葉細胞質膜在不同 pH值下的 Ca2+-ATPase的活性不同,是兩種器官在相應環(huán)境下的生化行為,這種行為為兩種器官在各自的環(huán)境中完成不同的功能提供了保證.

在對底物濃度的響應方面,菹草根和葉細胞質膜Ca2+-ATPase活性最大時所需的ATP濃度分別為 3,4mmol/L.根在底質中易受缺氧脅迫,有氧呼吸經(jīng)常受到不同程度的抑制,有時ATP供應不足,根細胞質膜Ca2+-ATPase可在較低ATP濃度下發(fā)揮作用,使Ca2+在遷移中更易進入根細胞.

植物體內較低的胞質游離 Ca2+濃度有利于Ca2+-ATPase行使第二信使功能,這種低鈣濃度的維持需要借助 Ca2+運輸系統(tǒng),Ca2+-ATPase是植物體具有高親和力的鈣離子運輸系統(tǒng)[5,17-19].在擬南芥中,根系細胞質膜 Ca2+-ATPase促進H+/Ca2+交換以加快對Ca2+的吸收[20].外界營養(yǎng)液鈣濃度增加維持了質膜 Ca2+-ATPase的活性,進而促進黃瓜根系吸收 Ca2+,并促進鈣信號的形成和逆境信號的體內傳遞,最終提高了黃瓜植株的低氧耐性[21].本試驗中,營養(yǎng)液中 Ca2+在 0～10-4mol/L之間提高了根和葉細胞質膜Ca2+-ATPase活性,Ca2+濃度＞10-4mol/L,Ca2+-ATPase活性開始下降,這與質膜 Ca2+濃度＞10mg/L(即＞2.5×10-4mol/L)后Ca2+-ATPase活性下降的現(xiàn)象剛好吻合.在另外的實驗中觀察到當培養(yǎng)液中 Ca2+濃度＞10mg/L后,菹草根吸收和莖葉釋放Ca2+的速度明顯下降,可能與細胞質膜 Ca2+-ATPase活性在外界Ca2+濃度進一步增加而下降有直接的關系.

相同條件下,菹草根吸收 Ca2+離子的活力保持在相當旺盛的水平,而維持葉細胞中相當濃度的鈣,葉細胞質膜Ca2+-ATPase活性明顯低于根細胞質膜 Ca2+-ATPase活性,這說明沉積物中 Ca2+經(jīng)過菹草向上覆水遷移的動力之一是來自根與葉細胞質膜Ca2+-ATPase活性存在的能量差.

4 結論

4.1 菹草根、葉細胞質膜Ca2+-ATPase的最適反應溫度分別為40℃、45℃;菹草根細胞質膜中Ca2+-ATPase活性在pH值6.0時最高,葉細胞質膜中Ca2+-ATPase活性的最適pH值為7.0;在低ATP濃度范圍內,菹草根和葉細胞質膜 Ca2+-ATPase活性均隨著ATP濃度的增加而迅速上升,根細胞質膜Ca2+-ATPase在3mmol/L ATP活性最大,葉細胞質膜 Ca2+-ATPase活性在 4mmol/L ATP才達到最大;在低鈣濃度范圍內,菹草根和葉細胞質膜 Ca2+-ATPase活性隨 Ca2+濃度負對數(shù)的減小而升高,1.0×10-4mol/L Ca2+可使酶達到最大激活,Ca2+濃度進一步增加反而抑制了 Ca2+-ATPase活性,使酶活性有所下降.

4.2 當培養(yǎng)液中Ca2+濃度為10mg/L時,菹草根細胞質膜 Ca2+-ATPase活性最高;在 1～10mg/ LCa2+范圍內,Ca2+-ATPase活性隨培養(yǎng)時間的延長而增加,而在相同條件下,15mg/LCa2+濃度培養(yǎng)一段時間,Ca2+-ATPase活性銳減.

4.3 加鈣培養(yǎng)的菹草葉細胞質膜 Ca2+-ATPase活性顯著高于不加鈣培養(yǎng)的情況,即營養(yǎng)液中添加鈣相應提高了葉細胞質膜 Ca2+-ATPase活性;在營養(yǎng)液的培養(yǎng)下,隨著培養(yǎng)時間的延長,菹草葉細胞質膜 Ca2+-ATPase活性與對應條件下根細胞質膜 Ca2+-ATPase活性的變化趨勢一致,從而說明,維持環(huán)境中一定強度的鈣濃度是菹草生長中能量代謝和離子平衡的需要.

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Impact of environmental factors on Ca2+-ATPase activity of Potamogeton crispus root and leaf plasma membrane.

XIAO Peng-cheng, ZHU Duan-wei*, LUO Yuan, WAN Xiao-qiong, CAI Jian-bo (Laboratory of Plant Nutrition and Ecological Environment Research, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China). China Environmental Science, 2012,32(6)：1123～1128

Ca2+-ATPase activity of P. crispus root and leaf plasma membrane was studied by changing the solution conditions including temperature, pH value, ATP concentration, and calcium concentration. The results indicated that the activity of root plasma membrane Ca2+-ATPase reached the maximum at pH 6.0 and 40 ℃, while the leaf enzyme highly activated at a broad range of pH at an optimum reaction temperature of 45℃. Plasma membrane Ca2+-ATPase activity in the root reached the maximum at 3 mmol/L ATP and in the leaf at 4 mmol/L ATP in the solution. P. crispus root and leaf plasma membrane Ca2+-ATPase activity increased up to the presence of 10-4mol/L calcium in the solution. The alteration of CaCl2concentration in culture solution for P. crispus cultivation resulted in different Ca2+-ATPase activity in both root and leaf plasma membrane. The root plasma membrane Ca2+-ATPase activity was higher than in the leaf, and the difference was more remarkable with increments of calcium in the culture solution. At lower concentration of calcium than 10 mg/L (2.5×10-4mol /L) in the culture solution, the Ca2+-ATPase activity was raised gradually. Between 10 mg/L to 15 mg/L, Ca2+-ATPase activity dropped sharply, which is in agreement with the impact of calcium concentration on Ca2+-ATPase activity.

Potamogeton crispus；root；leaf；plasma membrane；Ca2+-ATPase

2011-09-28

國家自然科學基金資助項目(40973056);博士點基金(20100146110020)

* 責任作者, 教授, zhudw@mail.hzau.edu.cn

X171.5

A

1000-6923(2012)06-1123-06

肖鵬程(1984-),女,湖南邵陽人,華中農(nóng)業(yè)大學碩士研究生,主要研究方向為植物營養(yǎng)與生態(tài)環(huán)境.