王來栓 張金萍 吳冰冰 蔣思遠 張 蓉 夏 慶

大量臨床和實驗研究表明宮內(nèi)感染或炎癥反應(yīng)不僅是導(dǎo)致早產(chǎn)的原因，同時也是導(dǎo)致新生兒死亡和嚴重傷殘的重要原因[1,2]。由于少突膠質(zhì)細胞(OL)是早產(chǎn)兒腦室周圍白質(zhì)軟化(PVL)發(fā)生的靶細胞和導(dǎo)致腦癱發(fā)生的直接原因，對其發(fā)育、分布、增殖、分化和受損特點已有了較清楚的認識。 OL具有成熟度依賴“選擇性”易損的特點：PVL發(fā)病“窗口期(孕23～32周)”的OL高度易損，而發(fā)育早期OL和成熟OL卻不易受損[3]，并且發(fā)現(xiàn)OL自身抗氧化能力不足是造成對促炎細胞因子、氧自由基和興奮性氨基酸等易損性的內(nèi)在機制。促炎細胞因子和氧自由基主要由活化的小膠質(zhì)細胞(MG)釋放，而對MG的正常分化發(fā)育和活化后與少突膠質(zhì)細胞前體細胞(OPCs)在PVL中的作用研究還非常有限。本研究假設(shè)MG的發(fā)育分布與OL細胞平行是早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷的關(guān)鍵所在。為此，通過分析不同孕齡C57B/L胎鼠MG、OL和神經(jīng)元發(fā)育相關(guān)性，并通過脂多糖(LPS)宮內(nèi)感染模型證實上述假設(shè)。

1 方法

1.1 實驗動物 C57B/L孕小鼠購自中國科學(xué)院上海實驗動物中心，SPF環(huán)境下飼養(yǎng),雌雄鼠按2∶1配對,各分為8籠交配繁殖。

1.2 MG發(fā)育分析 取C57B/L胎齡10、15 d孕鼠，出生后0、5、10 d 新生鼠各6只，予水合氯醛350 mg·kg-1腹腔注射麻醉后沿升主動脈依次灌入生理鹽水和4%多聚甲醛(pH 7.4)，取出腦組織后固定于4%多聚甲醛中過夜，依次置于20%、30%蔗糖溶液中至組織塊下沉。腦組織塊在-20℃的恒冷切片機上行30 μm的連續(xù)冠狀切片。Tomato lectin作為靜止期MG的特殊抗體進行染色，O4+作為OPCs抗體以浮片法進行免疫組化染色。參照腦立體定位圖譜選取4個胼胝體平面進行陽性細胞計數(shù)，油鏡計數(shù)腦室旁白質(zhì)4個不同平面陽性細胞數(shù)(每一切片為5 000 μm2),得出平均陽性細胞的密度。

1.3 LPS宮內(nèi)感染模型制備 無菌LPS O111：B4干粉溶解于PBS液中,使其終濃度為1 g·L-1。取胎齡15 d的孕鼠,2%戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1) 腹腔注射麻醉后消毒腹部皮膚,下腹行1 cm左右正中切口,找到左、右子宮角。以1 號皮試注射器注入不同劑量LPS于2個胎囊間。接種后310 號絲線連續(xù)縫合腹膜關(guān)閉腹腔,間斷縫合皮膚。術(shù)后置于清潔籠內(nèi),常規(guī)喂養(yǎng)。

依據(jù)LPS注射劑量(5、10和20 μg·mL-1)分為感染A～C組，對照組為接種等量PBS液，每組各8只。各組待自然分娩后72 h按1.2項下的標本處理方法制作冠狀病理切片，分別行CD68(活化MG的特殊抗體)、O4+免疫組化染色和分析。

1.4 促炎細胞因子檢測 各組切割腦室周圍白質(zhì)組織標本后，稱取重量，液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后保?～8℃。加入一定量的PBS(pH 7.4)，用勻漿器將標本勻漿充分。離心20 min(2 000～3 000 r·min-1)。采用抗體夾心法快速檢測IL-2、TNF-α和SOD含量，分析各細胞因子變化趨勢與腦損傷關(guān)系。

1.5 Western blot檢測TLR-4蛋白表達 各組腦室周圍白質(zhì)組織用總蛋白抽提試劑抽提總蛋白并進行蛋白質(zhì)定量。根據(jù)蛋白定量上樣,變性聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳(SDS-PAGE)分離,并以濕法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜，膜在5%脫脂奶粉溶液中室溫孵育1 h以封閉膜上的非特異結(jié)合。用大鼠抗小鼠TLR4抗體(1∶1 000) 4℃ 孵育過夜。洗去一抗,再與辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗大鼠IgG(1∶5 000)反應(yīng),增強化學(xué)發(fā)光法顯色,X線底片曝光顯影。結(jié)果用圖像處理儀進行灰度掃描分析,并以穩(wěn)定表達的基因β-actin作為內(nèi)參照計算目標條帶與β-actin的比值(%)。

2 結(jié)果

2.1 MG的增長移行和分布特征 Tomato lectin陽性MG和O4+細胞在孕10 d表達開始增加，但之后呈現(xiàn)胎齡依賴的表達顯著增加(孕15 d、出生后0 d表達最高)，MG主要分布在腦室周圍白質(zhì)區(qū)域，灰質(zhì)皮質(zhì)幾乎不表達。生后腦室周圍白質(zhì)區(qū)域的MG和O4+細胞表達逐漸降低，灰質(zhì)皮質(zhì)的表達呈逐漸增高趨勢(表1，圖1)。

圖1 MG的增長移行和分布

Fig 1 Distribution of activated microglia using Tomato lectin

Notes A: Numerous activated microglia in the white matter of a 15 gestational days mouse fetus; B: Negligible Tomato lectin-immunopositive cells in the cortex of the same mouse fetus; C: No Tomato lectin-immunopositive cells in the white matter of a 10 days postnatal mouse

TomatolectinO4+E1010.3±2.51)14.8±4.71)E1514.7±3.81)20.0±4.31)P013.4±3.91)11.2±4.31)P54.8±1.45.6±1.3P103.8±1.75.3±3.1

Notes E10:10 gestational days; E15:15 gestational days; P0: 0 day after birth; P5: 5 days after birth; P10: 10 days after birth.1) compared with P5 and P10,P<0.05

2.2 LPS宮內(nèi)感染對腦室周圍白質(zhì)組織MG和OPCs影響 隨接種LPS劑量的增加，CD68+細胞數(shù)量較對照組呈顯著的增加趨勢，但感染C組和B組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；感染A～C組O4+細胞較對照組呈顯著下降趨勢，感染C組下降最為顯著(表2)。

2.3 LPS宮內(nèi)感染對腦室周圍白質(zhì)組織IL-2、TNF-α和SOD的影響 隨接種LPS劑量增加，IL-2和TNF-α水平較對照組呈顯著增加趨勢，但感染B和C組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。SOD水平呈顯著降低趨勢，感染B和C組均顯著低于對照組(表2)。

PBSLPS(μg·mL-1)51020CD68+12.1±1.520.7±2.11)26.7±3.81)27.4±3.21)O4+10.1±1.64.8±1.31)4.0±1.01)2.2±0.61)IL-25.1±1.510.7±2.11)14.7±3.81)13.4±3.91)TNF-α0.1±0.024.4±1.21)7.1±2.41)10.5±2.51)SOD6.1±1.84.2±1.33.0±1.01)2.2±0.61)

Notes 1) compared with PBS group,P<0.01. CD68+and O4+were described as number·mm-2; IL-2,TNF-α and SOD were described as ng·mL-1

2.4 LPS宮內(nèi)感染對TLR-4蛋白表達的影響 對照組未檢測到TLR-4蛋白,感染A組可檢測到明顯的TLR-4蛋白，隨接種LPS劑量增大，感染B和C組TLR-4蛋白表達較對照組呈顯著增高趨勢(P<0.05)。

圖2 不同劑量LPS誘導(dǎo)宮內(nèi)感染3日齡新生鼠腦室周圍白質(zhì)組織MG TLR-4蛋白表達比較

Fig 2 TLR-4 protein expression of periventricular microglia following different doses of LPS induced intrauterine infection

Notes 1) compared with PBS group,P<0.01

3 討論

研究表明，早產(chǎn)兒的預(yù)后很大程度上取決于腦的發(fā)育程度和損傷程度。早產(chǎn)兒腦損傷是發(fā)育過程中的腦損害，主要發(fā)生在腦白質(zhì)。流行病學(xué)資料顯示PVL是痙攣性腦癱的主要原因，而圍生期感染是早產(chǎn)和PVL發(fā)生的重要因素。Meta分析結(jié)果證實母親患絨毛膜羊膜炎是發(fā)生PVL和腦癱的獨立危險因素[4,5]。既往研究更多的是關(guān)注PVL受損的靶細胞OPCs,而對于PVL形成的始動上游機制和為何是以白質(zhì)受損為主等問題尚缺乏足夠的了解和重視。

本研究對C57B/L鼠正常MG的發(fā)育特點進行了研究。通過常規(guī)和免疫組化染色相結(jié)合的方法，發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)固有免疫細胞MG發(fā)育也存在腦發(fā)育成熟度依賴的特點。孕10 d低表達MG，隨著胎齡的增加，MG在腦白質(zhì)的表達逐漸增多，呈現(xiàn)出從深部白質(zhì)到灰質(zhì)皮質(zhì)梯度分布的特征，而足月出生后腦白質(zhì)的MG逐漸減少并遷移到灰質(zhì)皮質(zhì)，腦白質(zhì)MG高峰期的表達出現(xiàn)在孕10、15 d，與OPCs發(fā)生的易損期高度一致。這種發(fā)育上的一致性在于分泌更多的神經(jīng)營養(yǎng)因子,從而最大程度的保護易損期OPCs和促進其分化成熟作用，但活化MG介導(dǎo)的抗感染和免疫損傷作用并存加上OPC內(nèi)在的易損性，對于平行發(fā)育的OPCs而言，MG在PVL發(fā)病中起到始動作用。本研究結(jié)果與最近報道的人MG發(fā)育特點一致，進一步表明MG活化在 PVL發(fā)病中的關(guān)鍵作用[6]，也提示研究MG的激活機制，從而調(diào)控MG的活化程度可能成為治療PVL的新靶點[7]。

作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)固有的免疫細胞，宮內(nèi)感染時，MG活化并介導(dǎo)固有免疫，發(fā)揮吞噬細胞功能。本研究結(jié)果顯示接種LPS后，呈現(xiàn)LPS劑量依賴的CD68+MG細胞數(shù)量的顯著增加和O4+OPCs細胞數(shù)量顯著減少，提示MG由OPCs正常發(fā)育時的保護作用變成了受損時的“加速器”，表明MG是OPCs受損的物質(zhì)基礎(chǔ)，進一步驗證了MG的作用。

固有免疫系統(tǒng)主要是通過一系列基因保守且穩(wěn)定的細胞表面受體,即模式識別受體,識別病原體不同的分子結(jié)構(gòu),即病原體相關(guān)分子模式。這類受體命名為TLR ，其中LPS與TLR-4特異性結(jié)合是MG介導(dǎo)固有免疫的必要條件。早產(chǎn)兒PVL動物實驗表明，MG是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)唯一高表達TLR-4和特異結(jié)合熒光標記LPS的細胞群，體外實驗證實LPS不能直接導(dǎo)致靶細胞OPCs損傷，必需有MG的活化和TLR-4的表達，活化的MG分泌促炎細胞因子和趨化因子等并轉(zhuǎn)化為吞噬細胞，發(fā)揮非特異的免疫反應(yīng)，以有效清除病原微生物[8]。TLR-4基因缺失小鼠對LPS的反應(yīng)性和炎癥反應(yīng)的程度顯著降低[9]，提示TLR4在固有免疫中的重要作用。本研究結(jié)果顯示，接種LPS后，TLR-4蛋白表達增加，并呈現(xiàn)劑量依賴性，與文獻報道較為一致。

氧自由基在PVL 的發(fā)病中起著重要的作用，其還可以與炎癥因子和興奮性氨基酸等的相互作用，從而增強彼此的致病性。本研究也發(fā)現(xiàn)隨著炎癥反應(yīng)的加重，IL-2、TNF-α等炎癥因子水平顯著增高，SOD這一重要的氧自由基清除劑水平顯著下降。

總之，MG的發(fā)育和增殖階段與OL一致，是OL受損的物質(zhì)基礎(chǔ)，OL受損是宮內(nèi)感染后MG的活化和增殖的必然結(jié)果?；罨腗G的表達高峰與PVL發(fā)病的高峰期吻合，導(dǎo)致靶細胞OL的受損?？垢腥久庖邔λ拗鞯谋Ｗo和損傷作用平行的基礎(chǔ)是MG和OPCs的平行發(fā)育。

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