嚴(yán) 愷 魏 欣 董 菊 蔡文萍 孫 荷 石小翔 李 雁 侯 紅 嚴(yán)衛(wèi)麗

已有證據(jù)表明如病毒感染［1，2］、自身免疫性疾?。?］等環(huán)境因素可影響CD4+、CD8+T 細(xì)胞的數(shù)量及功能變化，當(dāng)然也伴隨作用于淋巴細(xì)胞的生成及發(fā)展的遺傳因素［4］。結(jié)合環(huán)境與遺傳因素考慮，雙生子研究可被用來定量估計影響表型的遺傳及環(huán)境效應(yīng)大小。Hall 等［5］于2000 年針對成年健康人群研究得出了CD4+、CD8+T 細(xì)胞的遺傳度，同時認(rèn)為加性遺傳效應(yīng)對成年人群CD4+、CD8+T 細(xì)胞亞群數(shù)量有著重要影響。隨后該團(tuán)隊又在2002 年選取不同染色體上的基因位點進(jìn)一步證實了先前的研究結(jié)論，即發(fā)現(xiàn)這些基因與CD4+和CD8+T 細(xì)胞的數(shù)量或功能變化存在關(guān)聯(lián)［6］。因機(jī)體感染可能引起體內(nèi)T 細(xì)胞數(shù)量的波動［1］，Clapperton 等［7］選擇在無病原體級環(huán)境下飼養(yǎng)的健康豬群進(jìn)行研究，以普通級環(huán)境下飼養(yǎng)的豬群作為對照，觀察無病原體環(huán)境下豬群的免疫狀況。在無病原體影響下計算得到的豬淋巴細(xì)胞遺傳度可能更趨于真實，因此針對健康人群的CD4+、CD8+T 細(xì)胞遺傳度的研究更為有意義。關(guān)于幼兒人群的淋巴細(xì)胞遺傳度研究，國內(nèi)外尚未見相關(guān)報道。本文基于雙生子研究，應(yīng)用Mx 軟件及構(gòu)建結(jié)構(gòu)方程模型的方法，來探討幼兒雙生子人群CD4+、CD8+T細(xì)胞的遺傳度，定量分析影響CD4+和CD8+T 細(xì)胞的遺傳和環(huán)境效應(yīng)。

1 方法

1.1 樣本量計算 本研究是以滿1 周歲雙生子為研究對象的經(jīng)典雙生子研究，探索導(dǎo)致幼兒外周血CD4+和CD8+T 細(xì)胞相對計數(shù)變化的遺傳和環(huán)境因素。樣本量及把握度計算通過Mx 軟件(Michael C. Neale，Department of Psychiatry，Virginia Institute for Psychiatric and Behavioral Genetics，Virginia Common Wealth)完成。按照α =0. 05、β=0.80 計算，參考國外報道成年人群CD4+和CD8+T 細(xì)胞的遺傳度40% ～60%［5，6］，所需樣本量為29 對雙生子，但因本研究選取的人群為剛年滿1 周歲的幼兒雙生子人群，并且考慮到樣本中含有漢族和維吾爾族，與既往研究不同，故保守估計遺傳度僅為0.3 的情況下，所需樣本量為135 對雙生子。

1.2 收集樣本醫(yī)院和時間 為保證納入雙生子研究對象能達(dá)到樣本量需要，選擇了新生兒年出生數(shù)量居新疆烏魯木齊市前5 位的醫(yī)院(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院、烏魯木齊市婦幼保健醫(yī)院、新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院、中國人民解放軍烏魯木齊總醫(yī)院和烏魯木齊市第一人民醫(yī)院)作為研究現(xiàn)場。估測上述5 所醫(yī)院新生兒年出生數(shù)量，樣本收集時間應(yīng)持續(xù)2 年。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) ①2009 年3 月1 日至2011 年3 月1 日出生的雙生子;②父母民族同為漢族，或同為維吾爾族;③孕期保健，孕婦分娩，雙生子生后1、3、6 個月和1 周歲時體格生長(身高、體重、胸圍、頭圍)等指標(biāo)評估，雙生子1 周歲時撫養(yǎng)情況調(diào)查均在研究現(xiàn)場完成;④出生時已按0-1-6方案全程接種乙肝疫苗者;⑤雙生子同時參加1 周歲生長發(fā)育體檢。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) ①雙生子中僅存留一子或均未存活者;②無法與納入對象直系親屬取得聯(lián)系者;③接種疫苗產(chǎn)地、類型或劑量未依據(jù)中國計劃免疫方案執(zhí)行(如采用非衛(wèi)生部統(tǒng)一配備的進(jìn)口疫苗、非常規(guī)重組酵母乙肝疫苗、超過常規(guī)注射劑量);④研究對象直系親屬不愿參加體檢者;⑤父母有乙肝感染史;⑥研究對象出生時病案中提示出生缺陷者;⑦1 周歲內(nèi)患重大疾病且未愈者;⑧1 周歲體檢時處患病狀態(tài)者。

1.5 醫(yī)學(xué)倫理 本研究于立項前已通過新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審查。所有研究對象在1 周歲體檢時向其父母說明研究目的及內(nèi)容，并征得其父母親(一方或雙方)的同意，由父母親代研究對象決定是否參加本研究。

1.6 問卷調(diào)查 問卷包括7 部分，①一般情況:雙生子出生序列、性別、出生日期和民族等;②母親孕期狀況:末次月經(jīng)時間、孕次、血型和體重增加狀況等;③母親分娩狀況:麻醉方式、分娩方式和產(chǎn)程、剖腹產(chǎn)原因和產(chǎn)后出血狀況等;④雙生子出生時信息:健康狀況、體重和身高等;⑤雙生子生長發(fā)育狀況:1、3、6 個月及1 周歲時的體重和身高等;⑦雙生子1 周歲內(nèi)撫養(yǎng)情況:喂養(yǎng)方式、母乳喂養(yǎng)時間、撫養(yǎng)環(huán)境、患病史和輔食攝入時間等。其中一般情況、母親分娩狀況和雙生子出生時狀況等信息來源于各個醫(yī)院在檔病案，由經(jīng)統(tǒng)一培訓(xùn)的調(diào)查員填入問卷。母親孕期狀況及雙生子生長發(fā)育狀況等信息在研究對象滿1 周歲體檢時由研究人員對母子保健本上信息進(jìn)行登記或面對面的詢問方式獲得。

1.7 體格檢查 根據(jù)“1995 年中國九市7 歲以下兒童體格發(fā)育調(diào)查研究”方法測量身長、體重、頭圍和胸圍［8］，身長采用上海金羊衡器廠生產(chǎn)的臥式標(biāo)準(zhǔn)測量床，讀數(shù)精確至0.1 cm;體重采用最大載重為15 kg 的上海金羊嬰幼兒專用杠桿式磅秤，以kg 為單位，讀數(shù)精確至0.1 kg;頭圍和胸圍采用軟尺測量，讀數(shù)均精確至0.1 cm。

1.8 實驗室檢測 使用真空負(fù)壓EDTA-K3 抗凝管采集雙生子新鮮全血2 mL，于當(dāng)日送新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院科研中心流式細(xì)胞實驗室測定CD4+和CD8+T 細(xì)胞相對計數(shù)。

1.8.1 主要材料與儀器 針對淋巴細(xì)胞表面分化抗原不同選擇不同熒光素標(biāo)記的單克隆抗體:CD4 異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的小鼠抗人單克隆抗體(批號IM0448U，克隆號13B8.2)，8℃保存;CD8 藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的小鼠抗人單克隆抗體(批號IM0452U，克隆號B9.11)，8℃保存;溶血素為OPtilyse?C 免洗紅細(xì)胞裂解試劑(A11894)，常溫下保存，均由美國Beckman-Coulter 和法國Immunotech SAS 公司生產(chǎn)。Coulter 流式細(xì)胞儀專用IsoFlow 鞘液和Coulter Clenz 清洗液(美國Beckman-Coulter 公司)。EPICS-Altra?四色流式細(xì)胞儀及其配套的計算機(jī)軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，帶自動進(jìn)樣裝置及配套數(shù)字信號處理技術(shù)(美國Beckman-Coulter?公司)。

1.8.2 實驗步驟 使用直接免疫熒光標(biāo)記全血溶血法，測定研究樣本外周血淋巴細(xì)胞及其亞群，按說明書操作。通過流式細(xì)胞儀分析應(yīng)用Cell Quest 軟件熒光散點圖分別計數(shù)5 000 個淋巴細(xì)胞，標(biāo)記出CD4+和CD8+T 細(xì)胞的百分率。

1.9 卵型鑒定 微衛(wèi)星DNA 基因分型技術(shù)由上海晶能生物公司實驗室完成。采用美國GentraDNA 提取試劑盒，從EDTA 抗凝血中提取 DNA;使用 ABI 公司的AmpliTaqGoldRDNA 試劑盒，在ABI GeneAmpR9700 型PCR擴(kuò)增儀上復(fù)合擴(kuò)增15 個STR 位點(D3S1358、TH01、

D21S11、D18S51、Penta E、D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO、Penta D、vWA、D8S1179、TPOX、FGA)以及性別標(biāo)記Amelogenin;取擴(kuò)增產(chǎn)物于ABI PRISMR3100 型DNA 遺傳分析儀上電泳，最后用GeneMapperR Versions 3.1軟件分析數(shù)據(jù)和自動分型，進(jìn)行鑒定。每個微衛(wèi)星標(biāo)記掃描的結(jié)果有兩個峰值，如為同卵純合子，兩個峰值應(yīng)相同，反之為異卵雜合子。因此性別和15 個STR 位點基因型全部一致者判定為同卵雙生子(MZ)，而性別不同和(或)有一個或以上的位點基因型不同者判為異卵雙生子(DZ)。該方法卵型鑒定的可靠性達(dá)99.6%以上［9］。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法 雙生子的所有數(shù)據(jù)使用Access 2003數(shù)據(jù)庫軟件采取雙人雙機(jī)方式錄入，在錄入數(shù)據(jù)檢查核對無誤后進(jìn)行邏輯核對，以確保原始數(shù)據(jù)錄入的準(zhǔn)確性。應(yīng)用Stata 11. 0 軟件(Stata Corp LP，College Station，TX，USA)對雙生子各組的一般信息和相關(guān)體型指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計描述并進(jìn)行相關(guān)性分析;應(yīng)用Mx 軟件包構(gòu)建結(jié)構(gòu)方程模型，并計算遺傳度［10］。首先分別計算MZ、DZ 兩個同胞間待分析性狀的組內(nèi)相關(guān)系數(shù)rMZ和rDZ，并進(jìn)行比較，當(dāng)rDZ≥1/2rMZ時擬合適用于ACE 模型，而相反當(dāng)rDZ＜1/2rMZ時提示存在顯性遺傳作用，擬合應(yīng)選用ADE 模型。采用Mx 軟件構(gòu)建單一性狀的ACE 或ADE 模型，得到χ2、P、AIC(Akaike＇ s Information Criterion)和 RMSEA (Root Mean Squared Error Approximation)值等。其中，χ2值結(jié)合P 值來檢驗?zāi)Ｐ烷g差異的顯著性，當(dāng)P ＞0.05 時表明擬合的兩者模型間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，即兩者模型間都可視為相對穩(wěn)定。AIC 值＜0 表示達(dá)到了較好的擬合效果，而且AIC 越小擬合效果越好。RMSEA 值通過排除樣本量對擬合效果的影響來判斷擬合優(yōu)度，RMSEA ＜0.10 表明擬合較好，＜0.05 表明擬合非常好。最后，結(jié)合專業(yè)知識分析遺傳效應(yīng)、共同環(huán)境效應(yīng)及非共同環(huán)境效應(yīng)各組分的作用，選擇出指標(biāo)最佳并且合適的模型得到各通徑系數(shù)值及遺傳度，進(jìn)而比較遺傳和環(huán)境因素對外周血CD4+和CD8+T 細(xì)胞的影響程度。

2 結(jié)果

2.1 雙生子一般情況 研究期間符合納入標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)過排除標(biāo)準(zhǔn)排除后進(jìn)入分析的雙生子共172 對，其中MZ 82 對，DZ 90 對，男性84 對，女性52 對，性別互異43 對。父母雙方均漢族151 對，均為維吾爾族21 對。表1 顯示MZ 和DZ組一般特征比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，CD4+T 細(xì)胞相對計數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.049 0)，但兩組數(shù)值都在正常參考值范圍內(nèi)，差異并無生物學(xué)意義，CD8+T 細(xì)胞和CD4+/CD8+T 細(xì)胞兩組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。

2.2 CD4+、CD8+T 細(xì)胞亞群與圍生期、生長發(fā)育指標(biāo)的相關(guān)性 表2 顯示，孕婦孕齡、孕期體重增加、Apgar 評分、母乳喂養(yǎng)時間和1 周歲時身高增長量與CD4+、CD8+T 細(xì)胞相對計數(shù)存在弱相關(guān)性，其中Apgar 評分在MZ 組和DZ組與CD4+T 細(xì)胞相對計數(shù)均呈弱正相關(guān)性(rMZ=0.16，rDZ=0.14，P ＜0.05)，其余指標(biāo)均未能在兩組中同時出現(xiàn)顯著相關(guān)結(jié)果。

表1 雙生子一般特征和CD4 +、CD8 + T 細(xì)胞亞群狀況Tab 1 General characteristics and CD4 + and CD4 + T cell subsets of twins

表2 雙生子CD4 +、CD8 + T 細(xì)胞亞群與圍生期、生長發(fā)育指標(biāo)的相關(guān)性(r，P 值)Tab 2 Correlations of CD4 + and CD8 + T cell subsets with perinatal period and growth variables for overall MZ and DZ twins(r，P value)

2.3 遺傳度全模型/子模型選擇及遺傳度計算 由于雙生子之間并非獨立樣本，在計算遺傳度之前，先將CD4+和CD8+T 細(xì)胞亞群數(shù)據(jù)以出生先后順序進(jìn)行分組，經(jīng)Shapiro-Wilk 正態(tài)性檢驗后，各組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布(P ＞0.05)，可以用結(jié)構(gòu)方程模型進(jìn)行遺傳度擬合。CD4+T 細(xì)胞:rMZ=0.288 6，rDZ=0.232 6，且rDZ＞1/2rMZ，適用包括加性基因、共享環(huán)境和非共享環(huán)境的ACE 模型(全模型)及其嵌套模型(子模型)。CD8+T 細(xì)胞:rMZ=0. 090 4，rDZ=0.283 9，且rDZ＞1/2rMZ，其遺傳度計算選擇ACE 模型進(jìn)行擬合。

表3 顯示，在CD4+T 細(xì)胞遺傳度模型擬合中，ACE、AE 模型擬合成功(RMSEA ＜0.1，P ＞0.05)，CE、E 模型并不符合擬合要求，未完成最佳擬合。ACE 和AE 模型間△χ2的比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P =0.200)，提示在模型中剔除共同環(huán)境效應(yīng)C 后對模型的擬合優(yōu)度無顯著影響。考慮到AE 為精簡模型，故選擇AE 模型為最終擬合模型。由此得到CD4+T 細(xì)胞亞群的遺傳度為61.8%(95%CI:38.3% ～74. 8%)，非共享環(huán)境效應(yīng)為38. 2% (95% CI:20.4% ～52.8%)。在CD8+T 細(xì)胞遺傳度模型擬合中，ACE 和AE 模型擬合成功，根據(jù)相關(guān)模型屬性RMSEA、AIC和△χ2的判定，選擇AE 模型為遺傳度擬合的最佳模型，獲得CD8+T 細(xì)胞亞群的遺傳度為57.3%(95%CI:34.5% ～70.2%)，非共享環(huán)境效應(yīng)為42. 7% (95% CI:26. 2% ～61.9%)。

表3 CD4 +和CD8 + T 細(xì)胞亞群遺傳度模型選擇及計算Tab 3 Best-fitting univariate models choosing and heritability estimating for CD4 + and CD8 +T cell subsets

3 討論

在有效的卵型鑒定基礎(chǔ)上，本研究應(yīng)用單因素結(jié)構(gòu)方程模型［10］，對雙生子對間對內(nèi)表型相似性及差異的比較，定量估計剛滿1 周歲幼兒外周血CD4+、CD8+T 細(xì)胞的遺傳和環(huán)境效應(yīng)大小。已有多項研究表明，CD4+和CD8+T細(xì)胞數(shù)值未見顯著性別差異［3，11，12］，故本研究在計算遺傳度的過程中未將性別與年齡作為隱變量進(jìn)行處理，單純選擇了單因素連續(xù)變量且僅包含雙生子樣本的結(jié)構(gòu)方差模型進(jìn)行分析。在選擇ADE 與ACE 模型之前，通過組內(nèi)相關(guān)系數(shù)的分析，根據(jù)模型選擇原則［10］，發(fā)現(xiàn)CD4+和CD8+T細(xì)胞亞群的組內(nèi)相關(guān)系數(shù)rDZ均＞1/2rMZ，未提示針對變量存在顯性遺傳作用(rDZ≤1/2rMZ)，因此最終選定ACE 模型實施擬合并將最后得到的嵌套模型(子模型)與全模型進(jìn)行逐一比較，之后根據(jù)模型選擇原則確定AE 為最佳的模型。

本研究結(jié)果顯示，CD4+和CD8+T 細(xì)胞遺傳度分別為61.8%和57.3%，兩種細(xì)胞的遺傳度均稍高于Hall 等［5，6］的研究結(jié)果(CD4+T 細(xì)胞遺傳度56%，95% CI:41% ～68%;CD8+T 細(xì)胞遺傳度57%，95%CI:43% ～67%)?？赡芘c以下因素有關(guān):①本研究選擇1 周歲健康幼兒雙生子作為研究對象，獲得的是同一年齡的研究對象表型，較年齡表型不一的人群更出色;②1 歲幼兒處于人體生長發(fā)育早期，其周圍所暴露的環(huán)境因素數(shù)量有限，且作用時間較短，環(huán)境因素影響表型的作用相對較小，與成年人群相比，該表型能更真實的體現(xiàn)遺傳效應(yīng)大小。

模型擬合中依據(jù)最佳模型判定標(biāo)準(zhǔn)，在允許剔除共享環(huán)境因素之后，非共享環(huán)境效應(yīng)分別占38.2%與42.7%。與遺傳度相反的是，幼兒影響CD4+和CD8+T 細(xì)胞數(shù)值的非共享環(huán)境效應(yīng)要小于成人。已有研究提示不同年齡的成人外周血CD4+和CD8+T 細(xì)胞數(shù)量存在顯著差異，從新生兒期到成年過程中CD4+T 細(xì)胞的表達(dá)可能是一個正常生理性逐漸增加的過程［16］。有研究檢測58 份胎兒臍血中CD4+和CD8+T 細(xì)胞數(shù)值低于成人水平［17］。提示年齡是影響CD4+和CD8+T 細(xì)胞表達(dá)的因素之一。本研究統(tǒng)一選取1 周歲幼兒作為研究對象，排除了年齡對CD4+和CD8+T 細(xì)胞亞群數(shù)值的影響，獲得的1 周歲表型遺傳度更加接近于真實值。

本研究觀察到影響CD4+和CD8+T 細(xì)胞表達(dá)的不僅只有年齡因素。與相關(guān)環(huán)境因素的相關(guān)性分析顯示，MZ組孕婦孕齡和CD8+T 細(xì)胞相對計數(shù)呈弱負(fù)相關(guān);DZ 組孕齡與CD4+T 細(xì)胞相對計數(shù)呈弱正相關(guān)。本研究結(jié)果與國外一項有關(guān)影響早產(chǎn)兒CD4+和CD8+T 細(xì)胞表達(dá)的環(huán)境因素研究［18］結(jié)果相吻合，該研究顯示早產(chǎn)兒CD8+、CD4+/CD8+T 細(xì)胞比值與孕齡、出生體重呈正相關(guān)，孕齡＜32 周組中的CD8+T 細(xì)胞數(shù)量較孕齡≥32 周組減少，提示孕齡未達(dá)足月可能會引起免疫功能下降;該研究還提示體重增長較低的早產(chǎn)兒CD4+T 細(xì)胞數(shù)量較低。本研究顯示，1 歲體重增加與CD4+T 細(xì)胞相對計數(shù)存在弱正相關(guān)，與文獻(xiàn)［18］研究結(jié)果相符。晚近研究顯示，出生時存在窒息缺氧史的兒童體內(nèi)可出現(xiàn)T 細(xì)胞亞群紊亂，導(dǎo)致CD4+T 細(xì)胞減少［19］。本研究觀察到Apgar 評分與CD4+T 細(xì)胞相對計數(shù)呈弱正相關(guān)，驗證了上述文獻(xiàn)的結(jié)論，但其具體影響機(jī)制仍尚待研究。

本研究結(jié)果中有意義的提示有3 點，①根據(jù)模型信息反饋，遺傳因素作用要比環(huán)境因素對幼兒外周血CD4+和CD8+T 細(xì)胞亞群相對計數(shù)的影響更大;②再次證實了遺傳因素和環(huán)境因素共同影響幼兒外周血CD4+和CD8+T 細(xì)胞亞群相對計數(shù);③幼兒CD4+和CD8+T 細(xì)胞遺傳度要高于成年人群。本研究的局限性:①機(jī)體免疫功能水平可通過較多指標(biāo)進(jìn)行反映，研究只選取了CD4+和CD8+T 細(xì)胞相對計數(shù)作為表型，未涉及檢測其他具有重要臨床意義的免疫功能水平指標(biāo);②研究中未對淋巴細(xì)胞絕對計數(shù)進(jìn)行檢測，無法確定其他潛在因素對CD4+和CD8+T 細(xì)胞的影響，如幼兒體內(nèi)潛在的細(xì)菌或病毒感染;③對于探索導(dǎo)致幼兒體內(nèi)淋巴細(xì)胞亞群變化的遺傳-環(huán)境因素的研究，以外周血中CD4+和CD8+T 細(xì)胞相對還是絕對計數(shù)水平作為指標(biāo)還有待明確;④本研究僅分析了孕婦圍生期及幼兒生命早期生長發(fā)育的相關(guān)環(huán)境因素，在后續(xù)研究中可建議對其他因素進(jìn)行整合作進(jìn)一步系統(tǒng)性研究來深化研究結(jié)論。

致謝 感謝新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院、烏魯木齊市婦幼保健醫(yī)院、新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院、中國人民解放軍烏魯木齊總醫(yī)院和烏魯木齊市第一人民醫(yī)院兒童保健科對本研究歷時2 年的現(xiàn)場工作給予的大力支持，以及新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗中心向本研究提供的實驗技術(shù)平臺;感謝余莉華醫(yī)生、張雪實驗師等人在本項目實驗室指標(biāo)檢測環(huán)節(jié)給予的積極配合;對在《新生兒乙肝疫苗接種后弱無應(yīng)答的雙生子研究》課題進(jìn)行過程中付出過辛勤勞動的全體研究人員致以敬意。

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