施 磊，楊會勇，林俊生，刁 勇

(華僑大學(xué) 分子藥物學(xué)研究所，福建 泉州 362021)

核糖開關(guān)調(diào)控基因表達的熱力學(xué)與動力學(xué)機制

施 磊，楊會勇，林俊生，刁 勇

(華僑大學(xué) 分子藥物學(xué)研究所，福建 泉州 362021)

核糖開關(guān)是一種新型基因表達調(diào)控元件，一般存在于mRNA的非編碼區(qū)內(nèi)。當(dāng)核糖開關(guān)與特定配體分子結(jié)合后，其構(gòu)象發(fā)生相應(yīng)變化，然后啟動或阻斷mRNA的轉(zhuǎn)錄、翻譯、拼接等過程，行使基因調(diào)控的功能。近期研究發(fā)現(xiàn)，核糖開關(guān)對基因表達的調(diào)控不僅僅與配體分子的數(shù)量有關(guān)，還與mRNA轉(zhuǎn)錄速度有關(guān)，即存在熱力學(xué)與動力學(xué)調(diào)控兩種機制。對核糖開關(guān)介導(dǎo)的基因表達調(diào)控機制的深入了解，將促進其在生物技術(shù)及新藥研究等領(lǐng)域的應(yīng)用。

核糖開關(guān);熱力學(xué);動力學(xué);基因表達;調(diào)控

大多數(shù)生物都具有根據(jù)內(nèi)部和外部信號的變化而改變其基因表達模式的能力。傳統(tǒng)理論認(rèn)為感應(yīng)并調(diào)控基因表達的作用全部由蛋白質(zhì)所執(zhí)行，而最新研究表明，非編碼RNA也可以發(fā)揮重要的基因表達調(diào)控作用［1］。這些RNA具有原認(rèn)為是蛋白質(zhì)獨有的功能，如催化、配體識別等。隨著可特異性結(jié)合有機分子配體的RNA適體的發(fā)現(xiàn)［2］，在mRNA上存在的可調(diào)控基因表達的適體類序列引起了人們的關(guān)注［3］，并被命名為核糖開關(guān)。在調(diào)控基因表達方面，核糖開關(guān)與蛋白質(zhì)相比毫不遜色，并具有特異性高、敏感性高、表達調(diào)節(jié)響應(yīng)快等特點［4］。核糖開關(guān)廣泛存在于原核生物，在真菌及植物中也有發(fā)現(xiàn)。核糖開關(guān)在感應(yīng)特定代謝產(chǎn)物的變化后，通過調(diào)控 mRNA 的轉(zhuǎn)錄［5］、翻譯［6］、穩(wěn)定性［7］、或pre-mRNA的剪切［8］，發(fā)揮基因表達調(diào)節(jié)作用。

1 核糖開關(guān)的結(jié)構(gòu)特點

核糖開關(guān)均由兩部分結(jié)構(gòu)域組成(圖1):其一是負(fù)責(zé)與配體結(jié)合的適體結(jié)構(gòu)域(aptamer domain)，其二是負(fù)責(zé)表達調(diào)控的表達平臺(expression platform)［4］。適體結(jié)構(gòu)域序列高度保守，折疊后形成的結(jié)構(gòu)能保證其與配體特異性結(jié)合。適體結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)特征是區(qū)分各種類型核糖開關(guān)的依據(jù)。相對于適體結(jié)構(gòu)域，表達平臺的特異性就不非常明顯。當(dāng)配體與適體結(jié)構(gòu)域結(jié)合后，會引起下游表達平臺的RNA構(gòu)象變化，從而阻礙或促進mRNA的轉(zhuǎn)錄或翻譯等［9-11］。轉(zhuǎn)錄終止是核糖開關(guān)控制原核生物基因表達的常用機制，配體與核糖開關(guān)結(jié)合與否，導(dǎo)致終止子的形成或破壞，并分別引起轉(zhuǎn)錄的終止或延伸(圖2):當(dāng)適體結(jié)構(gòu)域沒有結(jié)合配體時，表達平臺形成穩(wěn)定的抗終止子結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄順利進行;當(dāng)與配體結(jié)合后，抗終止子與下游序列通過構(gòu)象變化，形成終止子結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄終止。

圖1 核糖開關(guān)的結(jié)構(gòu)

圖2 轉(zhuǎn)錄終止型核糖開關(guān)基因表達調(diào)控示意圖

2 核糖開關(guān)的熱力學(xué)調(diào)控機制

以適體/配體間解離常數(shù)(KD)為指標(biāo)的熱力學(xué)參數(shù)是核糖開關(guān)基因調(diào)控機制的重要因素，為促進配體與核糖開關(guān)的結(jié)合，配體的濃度必須超過其KD值。事實上，只要是有足量的配體存在，適體/配體復(fù)合物即可形成，并進行基因調(diào)控。一些核糖開關(guān)核酸適體的KD值在皮摩爾數(shù)量級，因此可以感應(yīng)極低濃度的代謝產(chǎn)物變化。核糖開關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域根據(jù)細(xì)胞內(nèi)靶配體濃度的高低變化改變自身構(gòu)象，表達平臺的構(gòu)象也相應(yīng)動態(tài)調(diào)整，決定下游序列是否繼續(xù)轉(zhuǎn)錄或翻譯。核糖開關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域必須能夠特異性地識別細(xì)胞內(nèi)濃度處于正常水平的靶配體 對其它結(jié)構(gòu)近似的代謝產(chǎn)物的正確區(qū)分，是有效避免調(diào)控錯誤的關(guān)鍵。采用配體指數(shù)富集系統(tǒng)進化技術(shù)(SELEX)，經(jīng)過10～15輪反復(fù)篩選可得到任何指定配體的人工適體［4］，但與已發(fā)現(xiàn)的核糖開關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域比較，這些人工適體的結(jié)構(gòu)較小、與配體的結(jié)合力較弱且特異性較低，說明上億年的進化演變已經(jīng)賦予核糖開關(guān)的適體序列以最佳的熱力學(xué)調(diào)控特征。

任何僅含有一個適體結(jié)構(gòu)域的核糖開關(guān)，其基因表達調(diào)控幅度如變化9倍，配體的濃度則需要變化81倍［12］，因此要求細(xì)胞必須能夠耐受某些代謝產(chǎn)物巨大的變化幅度。為了提高核糖開關(guān)基因調(diào)控的靈敏度，生物體還進化出“串聯(lián)”核糖開關(guān)結(jié)構(gòu)，配體的濃度變化40倍即可實現(xiàn)基因表達的9倍變化［13］。將多個適體整合在同一個核糖開關(guān)內(nèi)，是提高核糖開關(guān)熱力學(xué)調(diào)控特性更加精妙的策略。核糖開關(guān)內(nèi)兩個適體可以協(xié)同作用，任一適體與配體結(jié)合都可以相應(yīng)提高配體與另一個適體的親和力。配體濃度變化9倍，基因表達變化就可以達到9倍［14］。串聯(lián)核糖開關(guān)結(jié)構(gòu)使得RNA可以感應(yīng)代謝產(chǎn)物更小的濃度變化，敏感度完全可與蛋白因子媲美。

3 核糖開關(guān)的動力學(xué)調(diào)控機制

Wickiser等［15］發(fā)現(xiàn)黃素單核苷酸(FMN)核糖開關(guān)/配體間KD值大小與體內(nèi)可發(fā)揮調(diào)控作用的FMN濃度高低不一致，并首次提出核糖開關(guān)對基因的表達調(diào)控還存在動力學(xué)機制。當(dāng)FMN與核糖開關(guān)結(jié)合的速度慢于RNA聚合酶介導(dǎo)的mRNA延伸速度時，即使細(xì)胞內(nèi)FMN濃度高于KD值，mRNA仍然會繼續(xù)延伸而不發(fā)生終止。mRNA的模板DNA序列中存在暫停位點，可導(dǎo)致RNA聚合酶短暫地終止轉(zhuǎn)錄過程。這些轉(zhuǎn)錄暫停為核糖開關(guān)結(jié)合其特定的配體提供了額外的時間，從而有效地控制基因的表達［15］。如果在轉(zhuǎn)錄暫停期間，配體還不能與核糖開關(guān)結(jié)合并形成穩(wěn)定的特定構(gòu)象，mRNA則繼續(xù)延伸形成編碼序列。

核糖開關(guān)與配體結(jié)合以及構(gòu)象轉(zhuǎn)換的速度也是決定其調(diào)控機制是動力學(xué)還是熱力學(xué)過程的重要因素。如腺嘌呤核糖開關(guān)需要15 s左右才能形成穩(wěn)定的核糖開關(guān)/配體復(fù)合物，在這段時間內(nèi)RNA聚合酶足以從適體結(jié)構(gòu)域合成mRNA至表達平臺［16］。如果細(xì)胞內(nèi)存在有利于提高RNA聚合酶效率的因素，如適當(dāng)?shù)暮塑杖姿帷㈡V離子以及相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，則表現(xiàn)為動力學(xué)控制。另外，如果核糖開關(guān)構(gòu)象轉(zhuǎn)換的速度慢于與配體結(jié)合的速度，也表現(xiàn)為動力學(xué)控制。而當(dāng)核糖開關(guān)與配體結(jié)合后形成了較穩(wěn)定的構(gòu)象后，則表現(xiàn)為熱力學(xué)控制。

4 展望

與基因表達的蛋白調(diào)控系統(tǒng)比較，核糖開關(guān)不需要蛋白因子參與，免疫原性小;元件大小在數(shù)百堿基之內(nèi)，構(gòu)成非常簡單;響應(yīng)配體時間一般在數(shù)分鐘之內(nèi)，反應(yīng)迅速;核糖開關(guān)位于mRNA之上，發(fā)揮順式調(diào)節(jié)作用，可實現(xiàn)緊密調(diào)節(jié)。以上諸多優(yōu)點，使得核糖開關(guān)自發(fā)現(xiàn)之日起就引起了廣泛關(guān)注，日益深入的研究結(jié)果顯示其可以在代謝物檢測、新藥研但所有這些應(yīng)用前景的實現(xiàn)，必需基于對核糖開關(guān)作用機制的深入詳盡研究。

特別值得提及的是核糖開關(guān)還可以作為新藥研究的重要靶點。首先，已發(fā)現(xiàn)的核糖開關(guān)絕大多數(shù)存在于細(xì)菌內(nèi)，如以細(xì)菌核糖開關(guān)為靶點開發(fā)抗生素，則有可能克服對人體細(xì)胞交叉毒性。其次，已發(fā)現(xiàn)的核糖開關(guān)往往是調(diào)控細(xì)胞生存所必需的蛋白質(zhì)，以其為靶點的抗生素應(yīng)為殺菌性藥物。第三，核糖開關(guān)在進化過程中的相對保守性，也可能賦予針對該靶點的抗生素以廣譜性。Blount等［18］以枯草桿菌內(nèi)賴氨酸核糖開關(guān)為靶點成功開發(fā)了可抑制枯草桿菌生長的新型抗生素，說明了核糖開關(guān)靶點的可行性。

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Thermodynamic or kinetic control of riboswitch-mediated gene expression

SHI Lei，YANG Huiyong，LIN Junsheng，DIAO Yong
(Institute of Molecular Materia Medica，Huaqiao University，Quanzhou，362021，China)

Q78

A

1005-1678(2012)04-0509-03

2012-02-18

國際科技合作項目(2011DFG33320)

施 磊，男，碩士研究生，生物化學(xué)與分子生物學(xué)專業(yè)，E-mail:shllionshl@163.com; 林俊生，男，通信作者，教授，E-mail:ljunshengl@yahoo.com。