董 宇，矯筱蔓，王曉黎，孫 東

(1．遼寧省食品藥品檢驗(yàn)所，遼寧 沈陽(yáng) 110023;2．遼寧諾康生物制藥有限責(zé)任公司，遼寧 沈陽(yáng) 110071)

降纖酶肽圖分析

董 宇1，矯筱蔓1，王曉黎1，孫 東2

(1．遼寧省食品藥品檢驗(yàn)所，遼寧 沈陽(yáng) 110023;2．遼寧諾康生物制藥有限責(zé)任公司，遼寧 沈陽(yáng) 110071)

目的 采用反相高效液相色譜法測(cè)定尖吻蝮蛇降纖酶和白眉蝮蛇降纖酶肽圖。方法 將降纖酶樣品用胰蛋白酶水解，酶解所得的肽段通過(guò)反相高效液相色譜法進(jìn)行分析，采用C18色譜柱，以0．1%三氟乙酸為A相，乙腈-水-三氟乙酸(90∶10∶0．1)為B相進(jìn)行梯度洗脫得到降纖酶肽圖。結(jié)果 降纖酶各個(gè)肽段都能得到很好的分離，白眉蝮蛇降纖酶和尖吻蝮蛇降纖酶肽圖存在顯著差異。結(jié)論 本法簡(jiǎn)便、快速，可應(yīng)用于不同蛇種來(lái)源降纖酶的鑒別，以減少臨床不良反應(yīng)的發(fā)生。

降纖酶;肽圖;反相高效液相色譜法

我國(guó)降纖酶使用始于20世紀(jì)90年代，1997年國(guó)家衛(wèi)生部將以尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)和長(zhǎng)白山白眉蝮蛇(Gloydius ussuriensis)蛇毒為原料提取的類凝血酶制品正式命名為降纖酶(Defibrase)，制定并試行統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(于2003年上升為國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn))，以規(guī)范其產(chǎn)品質(zhì)量。然而，在臨床使用過(guò)程中，降纖酶不良反應(yīng)時(shí)有發(fā)生，常見(jiàn)的有患肢出血、皮下出血、皮膚出血、頸髓硬膜外出血與腦干出血等［1-2］。其原因在于不同來(lái)源的降纖酶具有不同的一級(jí)序列，在作用機(jī)理、空間結(jié)構(gòu)、免疫原性等方面也存在很大的差別。本文采用反相高效液相色譜法，對(duì)兩種不同來(lái)源的降纖酶進(jìn)行肽圖分析，確定其一級(jí)結(jié)果的完整性和準(zhǔn)確性，對(duì)兩種不同來(lái)源的降纖酶進(jìn)行鑒別和質(zhì)量控制。

1 儀器與藥品

美國(guó)Waters公司2695高效液相色譜儀，配有2996二極管陣列檢測(cè)器及2487紫外檢測(cè)器。

白眉降纖酶及尖吻降纖酶由遼寧諾康生物制藥有限責(zé)任公司提供;胰蛋白酶(TPCK處理)，Promega試劑公司;三氟乙酸、乙腈為色譜純;Millipore超純水;其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件

色譜柱:島津 VP-ODS(250 mm ×4．6 mm，5 μm);檢測(cè)波長(zhǎng):214 nm;柱溫:30 ℃;流速:1．0 mL/min;進(jìn)樣量:50 μL。流動(dòng)相A為0．1%三氟乙酸溶液，流動(dòng)相 B 為乙腈-水-三氟乙酸(90∶10∶0．1)。梯度洗脫程序?yàn)?0～4 min，2%流動(dòng)相 B;4 ～150 min，2% ～40%流動(dòng)相B;150 ～155 min，40% ～2%流動(dòng)相B。

2．2 樣品處理

稱取樣品適量，加1%碳酸氫銨緩沖液(pH 8．5)制成1 mg/mL溶液。按50∶1加入胰蛋白酶溶液。37℃水浴保溫4 h，95℃加熱10 min，10 000 r/min離心5 min，取上清液進(jìn)樣。

2．3 降纖酶肽圖比較

從圖1中可知，尖吻蝮蛇降纖酶分離出15個(gè)色譜峰，白眉蝮蛇降纖酶分離出25個(gè)色譜峰，兩種降纖酶的肽圖存在明顯差異。

圖1 尖吻蝮蛇降纖酶(A)和白眉蝮蛇降纖酶(B)肽圖Fig．1 Peptide mapping of Agkistrodon acutus defibrase(A)and Gloydius ussuriensis defibrase(B)

2．4 白眉蝮蛇降纖酶A、B組分分析

在采用反相高效液相色譜系統(tǒng)對(duì)白眉蝮蛇降纖酶整體蛋白進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，在C18色譜柱上，尖吻蝮蛇降纖酶為單一對(duì)稱色譜峰，而白眉蝮蛇降纖酶為分叉色譜峰。采用C4色譜柱進(jìn)行分離后，降纖酶可以完全分離出兩個(gè)色譜峰，推測(cè)白眉蝮蛇降纖酶不是單一組分，而是兩種蛋白的混合物。為比較兩種蛋白結(jié)構(gòu)的異同點(diǎn)，采用柱色譜方法，對(duì)白眉蝮蛇降纖酶進(jìn)行分離，分別得到兩個(gè)成分，命名為白眉蝮蛇降纖酶A組分和B組分。對(duì)A組分和B組分進(jìn)行肽圖分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2可知，白眉蝮蛇降纖酶A組分和B組分肽圖基本一致，僅在110～130 min處，個(gè)別色譜峰存在細(xì)微差異。

為進(jìn)一步證實(shí)白眉蝮蛇降纖酶A組分和B組分是否存在結(jié)構(gòu)上的明顯差異，采用糖苷酶對(duì)兩種組分進(jìn)行切糖處理后在C4色譜柱上進(jìn)行分析，得到保留時(shí)間完全一致的色譜峰。

圖2 白眉蝮蛇降纖酶A組分(A)和B組分(B)肽圖Fig．2 Peptide mapping of component A(A)and component B(B)of Gloydius ussuriensis defibrase

采用離子色譜法對(duì)白眉蝮蛇降纖酶A組分和B組分的糖譜進(jìn)行了測(cè)定。取凍干樣品適量用水溶解，加入三氟乙酸加熱水解后，在離子色譜儀上測(cè)定中性糖和唾液酸的種類及含量。結(jié)果表明，A組分和B組分均含有唾液酸和三種中性糖葡萄糖胺、半乳糖和甘露糖，且含量基本一致。

采用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(QTOF)對(duì)A組分和B組分進(jìn)行了質(zhì)量肽圖測(cè)定。取經(jīng)胰蛋白酶處理的樣品，以0．1%甲酸-水和0．1%甲酸-乙腈為流動(dòng)相，在C18色譜柱上進(jìn)行梯度洗脫。結(jié)果表明，兩組分的TIC及BPI色譜圖均無(wú)明顯差異，且經(jīng)BiopharmaLynx數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)兩者的色譜及質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，也無(wú)顯著性差異。

同時(shí)，委托北京大學(xué)生命科學(xué)院蛋白測(cè)序室進(jìn)行N-末端氨基酸序列測(cè)定，測(cè)定方法為edman降解法，測(cè)序儀器為美國(guó)Applied Biosystem公司 PROCISE 491，采用PVDF上樣程序。測(cè)定結(jié)果表明，兩種組分的N-末端15個(gè)氨基酸完全一致，均為VIGGDECNINEHRFL。

綜上，認(rèn)為白眉蝮蛇降纖酶A組分和B組分為結(jié)構(gòu)極為相近，其結(jié)構(gòu)上的細(xì)微差異主要來(lái)自于糖基化位點(diǎn)的不同和蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的不同，且兩種組分比活力接近。因此，由現(xiàn)有工藝精制得到的白眉蝮蛇降纖酶可以作為單一蛋白入藥，無(wú)需再進(jìn)行細(xì)分化。

3 討論

肽圖分析是通過(guò)蛋白酶或化學(xué)物質(zhì)裂解蛋白質(zhì)后，采用適宜的方法鑒定蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性和準(zhǔn)確性，是蛋白和多肽類藥物研究中極為有用的一項(xiàng)技術(shù)［3-5］。

本文采用反相高效液相色譜法對(duì)經(jīng)胰蛋白酶裂解后的尖吻蝮蛇降纖酶和白眉蝮蛇降纖酶肽段進(jìn)行分析，在中國(guó)藥典(2010年)三部附錄——肽圖檢查法的基礎(chǔ)上，對(duì)流動(dòng)相組成和洗脫梯度進(jìn)行優(yōu)化，得到的肽圖色譜峰個(gè)數(shù)更多，分離效果更佳。兩種不同來(lái)源的降纖酶肽圖存在顯著性差異，因此可采用本法進(jìn)行原料藥的鑒別和質(zhì)量控制。

同時(shí)，本文還分別采用肽圖、質(zhì)量肽圖測(cè)定、N-末端氨基酸序列分析、糖譜測(cè)定等分析手段證實(shí)了白眉蝮蛇降纖酶A組分和B組分結(jié)構(gòu)極為相近，得出了其可以作為單一蛋白入藥的結(jié)論，為白眉蝮蛇降纖酶生產(chǎn)工藝的優(yōu)化提供了有力依據(jù)。

［1］ 國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典臨床用藥須知(化學(xué)藥和生物制品卷)［M］．北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:513．

［2］ 趙小龍，安慧艷，牛長(zhǎng)玲．降纖酶的不良反應(yīng)［J］．中國(guó)藥房，2006，17(2):130-131．

［3］ 梁成罡，沈 舒，楊化新．重組人促卵泡激素(rhFSH)肽圖分析方法研究［J］．中國(guó)生化藥物雜志，2010，31(5):333-335．

［4］ 張 慧，辛中帥，李 晶，等．快速液相色譜在重組人胰島素肽圖分析中的應(yīng)用［J］．藥物分析雜志，2008，28(4):575-577．

［5］ 曾文珊，廖海明，楊仲元，等．肽圖分析在重組人甲狀旁腺素1-34產(chǎn)品質(zhì)量控制中的應(yīng)用［J］．中國(guó)藥學(xué)雜志，2006，41(4):1020-1022．

Peptide mapping analysis of defibrase

DONG Yu1，JIAO Xiao-man1，WANG Xiao-li1，SUN Dong2
(1．Liaoning Provincial Institute of Food and Drug Control，Shenyang 110023，China;2．Liaoning Nuokang Biopharmaceutical Co．，Ltd．，Shenyang 110071，China)

Purpose To develop a RP-HPLC method for peptide mapping analysis of Agkistrodon acutus defibrase and Gloydius ussuriensis defibrase．Methods The peptide mapping was obtained by trypsin hydrolysis and RP-HPLC detection．The analysis was performed on a C18column and the mobile phase consisted of 0．1%trifluotroacetic and acetonitrile-water-trifluotroacetic(90∶10∶0．1)with gradient elution．Results The digested fragments were well separated and there was a significant difference between Gloydius ussuriensis defibrase and Agkistrodon acutus defibrase．Conclusion The method is simple and rapid for identification of defibrase from different sources to reduce the occurrence of adverse reactions．

defibrase;peptide mapping;RP-HPLC

R927

A

1005-1678(2012)06-0822-03

2012-01-12

國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題(2008BAI55B04-3-2)

董 宇，女，主管藥師，碩士，從事藥品及食品檢驗(yàn)工作，E-mail:cutedongyu@hotmail．com。